奶牛瘤胃微生物蛋白酶和二肽基肽酶Ⅳ基因的筛选与多样性分析
发布时间：2021-07-30 15:05
在日粮蛋白质的降解过程中，蛋白酶是蛋白质水解为肽或氨基酸的关键酶，由于受到纯培养技术的影响，瘤胃内分泌蛋白酶的细菌和各种蛋白酶的基因信息知之甚少。本试验旨在利用蛋白酶选择性培养基从瘤胃微生物Fosmid文库中筛选出含蛋白酶活性的克隆子，通过生物信息学分析获得这些克隆子的基因信息。应用脱脂乳粉和大豆蛋白粉两种蛋白酶选择性培养基，从30000个克隆中筛选得到14个具有蛋白酶活性的阳性克隆。利用福林酚试剂法检测14个蛋白酶克隆子的酶活力，结果表明每个克隆子分别具有不同的蛋白质分解能力。以酪蛋白为底物的克隆子酶活力介于0.59-2.74U/mg之间；以大豆蛋白粉为底物的克隆子酶活力在0.70-7.19U/mg之间。pro10F末端序列与金属肽酶匹配度为54%，属于肽酶M13家族，且该克隆蛋白酶最适pH值为7.0。选取两个克隆利用鸟枪测序法进行测序，经GenMark分析，共获得了53个不同的蛋白序列，其中有两个属于不同的肽酶家族的序列片段。为了研究奶牛瘤胃内参与蛋白质降解过程中二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidases Ⅳ，DPP-Ⅳ）的序列特征和酶学性质，从奶牛瘤胃微生物Fosm...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：121 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
瘤胃氮代谢和微生物合成利用的关系
中国农业科学院博士学位论文 第二章 瘤胃微生物 Fosmid 文库蛋白酶阳性克隆的筛选与序列分2.2 结果与分析2.2.1 瘤胃 Fosmid 文库的复制结果本试验成功复制了瘤胃微生物 Fosmid 文库，共 81 个平板（30 000 个克隆），4 ℃保存，为续筛选试验做好准备。2.2.2 蛋白酶阳性克隆的筛选2.2.2.1 脱脂乳粉培养基的筛选通过菌落透明圈的变化，利用脱脂乳粉培养基对瘤胃微生物 Fosmid 文库的 30 000 个克进行了筛选，初筛得到了 21 个蛋白酶的阳性克隆，图 2-1 是其中 2 个阳性克隆的筛选结果。对述 21 个阳性克隆利用脱脂乳粉选择性培养基进行复筛，获得 3 个能够稳定表达蛋白酶活性的性克隆。
图 2-3 阳性克隆验证结果Fig 2-3 Verificative result of protease activity clones注：a 脱脂乳粉培养基筛选结果；b 大豆蛋白粉培养基筛选结果Note: A mean screening result of skim milk medium; B mean screening result of soybean protein medium.2.3 蛋白酶阳性克隆酶活性测定提取 14 个蛋白酶的活性克隆的粗酶液，对 2 种底物利用福林酚试剂方法检测 14 个活性粗酶活力，活性克隆分别命名为 pro1-pro14。结果表明，以酪蛋白为底物，除 pro7 没有测酶活性以外，14 个蛋白酶的活性克隆的酶活力中 9 个克隆的酶活力大于 1.95 U/mg，4 个酶活力低于这个值；pro1 酶活力最高为 2.74 U/mg，pro9 酶活力最低，其值为 0.59 U/mg。蛋白粉为底物，7 个克隆的酶活力大于 2.00 U/mg，6 个克隆酶活力小于这个值；pro11 酶高为 7.19 U/mg，pro13 酶活力最低，其值为 0.70 U/mg（图 2-4）。pro10 和 pro11 分解大豆的活力比其分解酪蛋白的活力高 3 倍多；pro5 和 pro13 分解酪蛋白的活力比其分解大豆蛋能力强。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Dipeptidyl peptidase-4: A key player in chronic liver disease[J]. Minoru Itou,Takumi Kawaguchi,Eitaro Taniguchi,Michio Sata. World Journal of Gastroenterology. 2013(15)
[2]云南药用野生稻BIBAC文库混合克隆池制备及筛选[J]. 刘艳平,程在全,殷富有,余腾琼,张敦宇,郭怡卿,张薇,黄兴奇. 生物技术通报. 2012(02)
[3]宏基因组学及其在瘤胃微生物中的应用研究进展[J]. 吴锡川,杨舒黎,苟潇,冷静,毛华明. 中国畜牧兽医. 2011(12)
[4]奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析[J]. 赵圣国,王加启,卜登攀,刘开朗,朱雅新,周凌云. 中国农业科学. 2011(05)
[5]尼罗罗非鱼微阵列Fosmid基因组文库的构建及基因筛选[J]. 李明辉,吴风瑞,熊传奇,曾圣,杨世杰,叶凯,蒋汶洮,孙运侣,黄宝锋,魏莹莹,焦静,顾源,王德寿. 水产学报. 2011(01)
[6]温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其一个杀线虫蛋白酶基因的筛选[J]. 赵志祥,芦小飞,陈国华,杨宇红,茆振川,刘二明,谢丙炎. 微生物学报. 2010(08)
[7]一个新型湖羊瘤胃木聚糖酶基因的克隆和鉴定[J]. 冯国栋,许艳艳,吕丹青,陈振明,张朝晖,周晓云. 科技通报. 2010(03)
[8]湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建和分析[J]. 王佳堃,安培培,陈振明,叶均安,刘建新. 动物营养学报. 2010(02)
[9]宏基因组学方法分析奶牛瘤胃尿素分解菌的多样性[J]. 赵圣国,王加启,刘开朗,李旦,于萍. 中国农业大学学报. 2010(01)
[10]荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析[J]. 李旦,王加启,卜登攀,刘开朗,李发弟. 微生物学杂志. 2009(06)
本文编号：3311625
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：121 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
瘤胃氮代谢和微生物合成利用的关系
中国农业科学院博士学位论文 第二章 瘤胃微生物 Fosmid 文库蛋白酶阳性克隆的筛选与序列分2.2 结果与分析2.2.1 瘤胃 Fosmid 文库的复制结果本试验成功复制了瘤胃微生物 Fosmid 文库，共 81 个平板（30 000 个克隆），4 ℃保存，为续筛选试验做好准备。2.2.2 蛋白酶阳性克隆的筛选2.2.2.1 脱脂乳粉培养基的筛选通过菌落透明圈的变化，利用脱脂乳粉培养基对瘤胃微生物 Fosmid 文库的 30 000 个克进行了筛选，初筛得到了 21 个蛋白酶的阳性克隆，图 2-1 是其中 2 个阳性克隆的筛选结果。对述 21 个阳性克隆利用脱脂乳粉选择性培养基进行复筛，获得 3 个能够稳定表达蛋白酶活性的性克隆。
图 2-3 阳性克隆验证结果Fig 2-3 Verificative result of protease activity clones注：a 脱脂乳粉培养基筛选结果；b 大豆蛋白粉培养基筛选结果Note: A mean screening result of skim milk medium; B mean screening result of soybean protein medium.2.3 蛋白酶阳性克隆酶活性测定提取 14 个蛋白酶的活性克隆的粗酶液，对 2 种底物利用福林酚试剂方法检测 14 个活性粗酶活力，活性克隆分别命名为 pro1-pro14。结果表明，以酪蛋白为底物，除 pro7 没有测酶活性以外，14 个蛋白酶的活性克隆的酶活力中 9 个克隆的酶活力大于 1.95 U/mg，4 个酶活力低于这个值；pro1 酶活力最高为 2.74 U/mg，pro9 酶活力最低，其值为 0.59 U/mg。蛋白粉为底物，7 个克隆的酶活力大于 2.00 U/mg，6 个克隆酶活力小于这个值；pro11 酶高为 7.19 U/mg，pro13 酶活力最低，其值为 0.70 U/mg（图 2-4）。pro10 和 pro11 分解大豆的活力比其分解酪蛋白的活力高 3 倍多；pro5 和 pro13 分解酪蛋白的活力比其分解大豆蛋能力强。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Dipeptidyl peptidase-4: A key player in chronic liver disease[J]. Minoru Itou,Takumi Kawaguchi,Eitaro Taniguchi,Michio Sata. World Journal of Gastroenterology. 2013(15)
[2]云南药用野生稻BIBAC文库混合克隆池制备及筛选[J]. 刘艳平,程在全,殷富有,余腾琼,张敦宇,郭怡卿,张薇,黄兴奇. 生物技术通报. 2012(02)
[3]宏基因组学及其在瘤胃微生物中的应用研究进展[J]. 吴锡川,杨舒黎,苟潇,冷静,毛华明. 中国畜牧兽医. 2011(12)
[4]奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析[J]. 赵圣国,王加启,卜登攀,刘开朗,朱雅新,周凌云. 中国农业科学. 2011(05)
[5]尼罗罗非鱼微阵列Fosmid基因组文库的构建及基因筛选[J]. 李明辉,吴风瑞,熊传奇,曾圣,杨世杰,叶凯,蒋汶洮,孙运侣,黄宝锋,魏莹莹,焦静,顾源,王德寿. 水产学报. 2011(01)
[6]温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其一个杀线虫蛋白酶基因的筛选[J]. 赵志祥,芦小飞,陈国华,杨宇红,茆振川,刘二明,谢丙炎. 微生物学报. 2010(08)
[7]一个新型湖羊瘤胃木聚糖酶基因的克隆和鉴定[J]. 冯国栋,许艳艳,吕丹青,陈振明,张朝晖,周晓云. 科技通报. 2010(03)
[8]湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建和分析[J]. 王佳堃,安培培,陈振明,叶均安,刘建新. 动物营养学报. 2010(02)
[9]宏基因组学方法分析奶牛瘤胃尿素分解菌的多样性[J]. 赵圣国,王加启,刘开朗,李旦,于萍. 中国农业大学学报. 2010(01)
[10]荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析[J]. 李旦,王加启,卜登攀,刘开朗,李发弟. 微生物学杂志. 2009(06)
本文编号：3311625
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