基于p53-SIRT6-Foxol轴下烟酸和非酯化脂肪酸对围产期羊肝细胞糖异生作用的影响研究
发布时间：2021-08-02 22:32
围产期是反刍母畜生产周期中最为关键的时期。该时期最大特点是能量负平衡,此阶段母畜的干物质采食量和血浆中的非脂化性脂肪酸（NEFA）水平会发生巨大的变化。烟酸可以通过NEFA和p53-SIRT6-Foxo1轴对肝脏糖异生过程进行调控,从而促进肝脏糖异生缓解能量负平衡。本研究以体外培养羊肝细胞为基础,探讨NEFA和烟酸对羊肝细胞增殖、糖异生限速酶以及p53-SIRT6-Foxo1轴相关基因的mRNA和蛋白的相关影响。本试验主要分为以下四个部分:试验一 利用两步灌流法对绵羊肝细胞进行体外培养。随后对培养的细胞进行形态和功能鉴定,细胞形态鉴定用糖原染色法检测,功能鉴定用细胞免疫荧光化学染色法检测。形态鉴定结果,显微镜下染色的细胞多为圆形或为卵圆形,形态大小不一。贴壁生长均匀分布,细胞胞体充盈饱满,细胞核分为单核或多核。观察到的细胞特征,符合肝细胞的形态特征。羊肝细胞的功能检测结果,肝细胞中CK18表达呈阳性,即测定细胞具有肝细胞的功能特点,测定细胞为肝细胞。此外对细胞周期和细胞存活率进行了检测,细胞周期符合肝细胞正常的生长周期,细胞存活率较高,可满足试验需求。试验二 肝细胞中添加NEFA,对羊...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图４本试验技术路线图??Ｆｉｇ．４?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ｒｏａｄｍａｐ?ｆｏｒ?ｔｈｉｓ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ??
?内蒙古农业大学硕士论文???２．１．２试验结果??２．１．２．１羊肝细胞的体外培养及鉴定结果??如图显微镜下对羊肝细胞进行观察，细胞多为圆形或为卵圆形，形态大小不??一。贴壁生长均匀分布，细胞胞体充盈饱满，细胞核分为单核或多核。观察到的??细胞特征，符合肝细胞的形态特征。目前肝细胞的培养方法分为胶原凝胶三明治、??微载体黏附、微囊包裹、球形聚集、中空纤维和单层培养法ｗ］。本试验采用的是??单层培养法。依据肝脏细胞的体外培养鉴定技术，进行细胞形态鉴定，本试验的??细胞形态与参考试验描述一致＾。??Ｉ?■■??。二?＇?：‘ｒ—ｉ?一、？??图５肝细胞成像图??Ｆｉｇ．５?Ｌｉｖｅｒ?ｃｅｌｌ?ｉｍａｇｉｎｇ??角蛋白ＣＫ１８是正常肝实质细胞中高特异性表面抗原，可用来鉴定肝细胞［Ｂ３］。??羊肝细胞培养后进行抗ＣＫ１８免疫荧光细胞化学染色，羊肝细胞中ＣＫ１８表达呈??阳性。即测定细胞具有肝细胞的功能特点，测定细胞为肝细胞。??图６免疫荧光检测图片＿??Ｆｉｇ．６?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｐｉｃｔｕｒｅ??肝细胞的总产量平均为１．１２ｘｌ〇６／ｇ。存活率达９０％以上，细胞培养后占贴??壁率达９０％以上。本试验的灌流液流速就在原有的基础上进行了调整，流速放缓??后，收集到的分离细胞增多。如图２０为羊肝细胞的生长曲线。从图中可以看出，??第１天细胞逐渐贴壁，３？４天细胞开始缓慢增殖，４？８天为细胞的快速増殖时期，??呈现出对数生长，随后进入衰退期。羊肝细胞的生长曲线是典型的“Ｓ”型。??
Ｊ２?内蒙古农业大学硕士论文???４０??３５??细??胞??密??虔：：??１５??／？！＂??：〇?ｙ??１?２?３?４?５?６?７?Ｅ?９?１Ｃ＇?ＸＩ?１２?１３??细胞生长天数／ｄ??图７羊肝细胞的生长曲线??Ｆｉｇ．７?Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ??２．１．３讨论??羊肝细胞通过改良的灌流法进行培养，细胞可持续培养超过２周。肝细胞培??养中，通过试验总结不断的对灌流法进行改良，细胞的存活率得到了有效提高??％８°］。本试验培养的羊肝细胞，经过肝细胞形态的观察和功能特征的鉴定，判断??培养的细胞为肝细胞。并且细胞的生长曲线为典型的“Ｓ”型生长曲线。细胞生长??状态良好。试验过程中通过对肝细胞进行纯化可得到纯度较高的肝细胞。??２．２?ＮＥＦＡ对羊肝细胞增殖糖异生及ｐ５３－ＳＩＲＴ６－Ｆｏｘｏｌ轴的影响??２．２．１试验方法与材料??２．２．１．１试验设计??试验材料为绵羊肝细胞，采用单因子完全随机试验处理，将培养９６ｈ处于对??数期生长状况良好的羊肝细胞随机分组，每组６个重复。每处理组的培养基中分??别添加ＮＥＦＡ（０、０．３、０．６、１．２、２．４、４．８）ｍｍｏｌ／Ｌ，处理时间分别为（０、??０．５、１、２、６、１２、２４、３６）ｈ进行细胞增殖率测定。依据增殖率对细胞进行ＮＥＦＡ??浓度和处理时间筛选后，测定选定后条件下细胞的ＰＣ、ＰＥＰＣＫ活性和相关基因??的ｍＲＮＡ表达量。??２．２．１．２测定方法??试验所需仪器及试剂：紫外分光光度计、Ｃ０２培养箱、酶标仪、恒温水浴锅??（均为Ｔｈｅｒｍｏ公司），ＣＣＫ８试剂盒、ＰＣ、ＰＥＰＣＫ
本文编号：3318389
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图４本试验技术路线图??Ｆｉｇ．４?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ｒｏａｄｍａｐ?ｆｏｒ?ｔｈｉｓ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ??
?内蒙古农业大学硕士论文???２．１．２试验结果??２．１．２．１羊肝细胞的体外培养及鉴定结果??如图显微镜下对羊肝细胞进行观察，细胞多为圆形或为卵圆形，形态大小不??一。贴壁生长均匀分布，细胞胞体充盈饱满，细胞核分为单核或多核。观察到的??细胞特征，符合肝细胞的形态特征。目前肝细胞的培养方法分为胶原凝胶三明治、??微载体黏附、微囊包裹、球形聚集、中空纤维和单层培养法ｗ］。本试验采用的是??单层培养法。依据肝脏细胞的体外培养鉴定技术，进行细胞形态鉴定，本试验的??细胞形态与参考试验描述一致＾。??Ｉ?■■??。二?＇?：‘ｒ—ｉ?一、？??图５肝细胞成像图??Ｆｉｇ．５?Ｌｉｖｅｒ?ｃｅｌｌ?ｉｍａｇｉｎｇ??角蛋白ＣＫ１８是正常肝实质细胞中高特异性表面抗原，可用来鉴定肝细胞［Ｂ３］。??羊肝细胞培养后进行抗ＣＫ１８免疫荧光细胞化学染色，羊肝细胞中ＣＫ１８表达呈??阳性。即测定细胞具有肝细胞的功能特点，测定细胞为肝细胞。??图６免疫荧光检测图片＿??Ｆｉｇ．６?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｐｉｃｔｕｒｅ??肝细胞的总产量平均为１．１２ｘｌ〇６／ｇ。存活率达９０％以上，细胞培养后占贴??壁率达９０％以上。本试验的灌流液流速就在原有的基础上进行了调整，流速放缓??后，收集到的分离细胞增多。如图２０为羊肝细胞的生长曲线。从图中可以看出，??第１天细胞逐渐贴壁，３？４天细胞开始缓慢增殖，４？８天为细胞的快速増殖时期，??呈现出对数生长，随后进入衰退期。羊肝细胞的生长曲线是典型的“Ｓ”型。??
Ｊ２?内蒙古农业大学硕士论文???４０??３５??细??胞??密??虔：：??１５??／？！＂??：〇?ｙ??１?２?３?４?５?６?７?Ｅ?９?１Ｃ＇?ＸＩ?１２?１３??细胞生长天数／ｄ??图７羊肝细胞的生长曲线??Ｆｉｇ．７?Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ??２．１．３讨论??羊肝细胞通过改良的灌流法进行培养，细胞可持续培养超过２周。肝细胞培??养中，通过试验总结不断的对灌流法进行改良，细胞的存活率得到了有效提高??％８°］。本试验培养的羊肝细胞，经过肝细胞形态的观察和功能特征的鉴定，判断??培养的细胞为肝细胞。并且细胞的生长曲线为典型的“Ｓ”型生长曲线。细胞生长??状态良好。试验过程中通过对肝细胞进行纯化可得到纯度较高的肝细胞。??２．２?ＮＥＦＡ对羊肝细胞增殖糖异生及ｐ５３－ＳＩＲＴ６－Ｆｏｘｏｌ轴的影响??２．２．１试验方法与材料??２．２．１．１试验设计??试验材料为绵羊肝细胞，采用单因子完全随机试验处理，将培养９６ｈ处于对??数期生长状况良好的羊肝细胞随机分组，每组６个重复。每处理组的培养基中分??别添加ＮＥＦＡ（０、０．３、０．６、１．２、２．４、４．８）ｍｍｏｌ／Ｌ，处理时间分别为（０、??０．５、１、２、６、１２、２４、３６）ｈ进行细胞增殖率测定。依据增殖率对细胞进行ＮＥＦＡ??浓度和处理时间筛选后，测定选定后条件下细胞的ＰＣ、ＰＥＰＣＫ活性和相关基因??的ｍＲＮＡ表达量。??２．２．１．２测定方法??试验所需仪器及试剂：紫外分光光度计、Ｃ０２培养箱、酶标仪、恒温水浴锅??（均为Ｔｈｅｒｍｏ公司），ＣＣＫ８试剂盒、ＰＣ、ＰＥＰＣＫ
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