CRISPR-Cas9敲减鹅硬脂酰辅酶A去饱和酶基因的慢病毒质粒构建

发布时间：2021-08-03 00:35

　　为进一步探究鹅卵泡颗粒细胞内源性脂肪酸合成代谢机制,利用CRISPR-Cas9技术构建靶向鹅硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD）基因的慢病毒敲减质粒并进行慢病毒包装。首先设计鹅SCD基因的单链指导RNA（single-guide RNA, sgRNA）序列,其次体外合成并验证裂解效率,最后利用psPAX2和pMD2.G包装质粒制备psgRNA-mCherry-T2A-Puro和pLenti-Cas9-T2A-EGFP慢病毒质粒。结果表明,慢病毒质粒被成功构建,且其感染中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞后筛选出能同时表达红色荧光蛋白和增强绿色荧光蛋白的强双阳性细胞群。这为后续感染鹅原代颗粒细胞并敲减其SCD基因研究奠定了基础。 

【文章来源】：浙江大学学报(农业与生命科学版). 2020,46(05)北大核心CSCD

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【部分图文】：

鹅SCD基因sg RNA靶点设计示意图

图1 鹅SCD基因sg RNA靶点设计示意图2.3 psg RNA-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP病毒感染CHO细胞分析

将感染后的CHO细胞扩繁消化，在BD FACSAriaⅡ流式细胞分析仪上分析细胞的荧光比例与强度。由图5可知，psg RNA1-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率为13.4%,psg RNA3-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率为11.2%,psg RNANC-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率为16.6%。利用分选仪器，分别筛选出强双阳性细胞群，并接种至24孔板中继续培养，在荧光显微镜下观察发现，筛选后的细胞能同时表达红色荧光蛋白和增强绿色荧光蛋白（图6）。3 讨论


本文编号：3318580