与兔出血症病毒相互作用的截短兔肝脏铁蛋白重链鉴定
发布时间：2021-08-03 03:33
兔病毒性出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）,俗称“兔瘟”,在中国的江苏地区首次爆发,兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV）属于兔病毒属中的嵌杯状病毒科（Calicivirus）,（?）够引起兔的急性、高度接触性、败血性传染病,通常给养兔业带来毁灭性的伤害。肝脏是RHDV侵染的主要器官,与RHDV相互作用蛋白的研究是重点研究领域之一。本实验室前期通过SMART技术筛选和鉴定了与VP60相互作用的相关候选蛋白。铁蛋白重链（Ferritin Heavy Chain, FTH）是与VP60相互作用的候选蛋白之一,并利用GST pull down. ELISA. Co-IP及血凝试验等方法验证了FTH与RHDV具有相互作用。本研究对铁蛋白重链截短,进行体外表达,鉴定铁蛋白重链与RHDV相互作用的位点,为抗病毒药物的研制提供帮助。为精确定位兔铁蛋白重链与RHDV相互作用的位点,本研究提取兔肝脏组织总RNA,采用RT-PCR技术扩增FTH基因并分节段克隆于pGEX-6P-1载体中,重组质粒在大肠杆菌BL21（...
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 兔病毒性出血症概况
1.2 病原学
1.3 临床症状及病理变化
1.3.1 临床症状
1.3.2 病理变化
1.4 流行病学特点
1.5 病毒生活周期
1.6 诊断方法
1.6.1 电镜法
1.6.2 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
1.6.3 凝(HA)和血凝抑制(HI)试验
1.6.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.6.5 环介导恒温快速扩增(LAMP)
1.6.6 实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1.7 防控和疫苗
1.8 研究蛋白质相互作用的方法
1.8.1 酵母双杂交
1.8.2 免疫共沉淀
1.8.3 GST-pull down
1.8.4 表达克隆系统技术
1.8.5 病毒铺覆蛋白试验(VOPBA)
1.9 铁蛋白研究进展
1.10 本研究的目的和意义
第二章 兔铁蛋白重链截短基因的克隆及序列分析
2.1 材料
2.1.1 实验动物与病毒
2.1.2 菌株及载体
2.1.3 酶及主要试剂
2.2 方法
2.2.1 基因扩增的策略
2.2.2 扩增引物的设计
2.2.3 细胞总RNA的提取
2.2.4 重组质粒的构建
2.2.5 克隆质粒的提取与测序鉴定
2.2.6 表达载体的构建
2.2.7 重组蛋白的表达
2.2.8 重组蛋白的纯化
2.3 结果
2.3.1 序列分析及表达载体的鉴定
2.3.2 FTH截短重组蛋白表达纯化
2.4 讨论
第三章 兔铁蛋白重链与RHDV相互作用位点的鉴定
3.1 材料和方法
3.1.1 质粒、毒株及菌株
3.1.2 主要化学试剂
3.1.3 主要设备
3.1.4 诱饵载体pGBKT7-X的构建及鉴定
3.1.5 捕获载体pGBKT7-Y的构建及鉴定
3.1.6 捕获载体pGADT7-Y的自激活检测和毒性检测
3.1.7 pGBKT7-X与pGADT7-Y共转化酵母菌AH109
3.1.8 ELISA验证FTH截短重组蛋白与RHDV具有相互作用
3.1.9 FTH截短重组蛋白中和RHDV的血凝试验
3.2 结果
3.2.1 RHDV病毒蛋白基因的扩增
3.2.2 诱饵载体pGBKT7-X的构建及鉴定
3.2.3 诱饵载体pGBKT7-X的毒性检测分析
3.2.4 诱饵载体pGBKT7-X的自激活检测分析
3.2.5 捕获载体pGADT7-Y的构建及鉴定
3.2.6 捕获载体pGADT7-Y的自激活和毒性检测
3.2.7 酵母双杂交验证结果
3.2.8 ELISA验证结果
3.2.9 血凝活性实验验证结果
3.3 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
附录
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]ELISA验证兔铁蛋白重链与RHDV VP60相互作用[J]. 孙宏勇,刘家森,王泽祥,陈淑慧,单丽玲,郭冬春,姜骞,林欢,曲连东. 中国预防兽医学报. 2013(09)
[2]兔出血症病毒衣壳蛋白与次级结构蛋白的相互作用[J]. 杨宗伟,倪征,云涛,陈宗艳,李传峰,刘光清. 科学通报. 2012(24)
[3]表达克隆技术在蛋白质相互作用研究中的应用[J]. 柳迪,唐丽,贺福初. 细胞与分子免疫学杂志. 2012(08)
[4]兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选[J]. 穆亚芳,刘家森,郭东春,李茂中,原冬伟,姜骞,林欢,曲连东. 中国预防兽医学报. 2011(05)
[5]兔病毒性出血症研究进展[J]. 汤少伟. 上海畜牧兽医通讯. 2010(05)
[6]酵母双杂交技术研究与应用进展[J]. 李先昆,聂智毅,曾日中. 安徽农业科学. 2009(07)
[7]TaqMan MGB探针实时检测兔病毒性出血症病毒[J]. 张秀娥,田夫林,李希友,李建亮,崔言顺. 中国兽医学报. 2007(06)
[8]遗传性酪氨酸血症Ⅰ型10例的临床诊断分析[J]. 李晓瑜,杜敏联,庄思齐,莫恩明,马华梅,李燕虹,陈红珊,丘小汕. 中华儿科杂志. 2006(06)
[9]与接头蛋白Bam32相互作用的蛋白分子的鉴定[J]. 程小星,蹇锐. 细胞与分子免疫学杂志. 2005(04)
[10]人肝癌组织中p53与HSP70相互作用的初步研究[J]. 崔崇伟,杨守京,刘雁平,刘彦仿. 细胞与分子免疫学杂志. 2003(02)
硕士论文
[1]兔铁蛋白重链与兔出血症病毒相互作用的研究[D]. 孙宏勇.中国农业科学院 2013
[2]人工感染兔出血症病毒兔肝脏的蛋白质组学分析[D]. 李茂中.中国农业科学院 2012
[3]兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定[D]. 穆亚芳.中国农业科学院 2011
本文编号：3318841
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 兔病毒性出血症概况
1.2 病原学
1.3 临床症状及病理变化
1.3.1 临床症状
1.3.2 病理变化
1.4 流行病学特点
1.5 病毒生活周期
1.6 诊断方法
1.6.1 电镜法
1.6.2 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
1.6.3 凝(HA)和血凝抑制(HI)试验
1.6.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.6.5 环介导恒温快速扩增(LAMP)
1.6.6 实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1.7 防控和疫苗
1.8 研究蛋白质相互作用的方法
1.8.1 酵母双杂交
1.8.2 免疫共沉淀
1.8.3 GST-pull down
1.8.4 表达克隆系统技术
1.8.5 病毒铺覆蛋白试验(VOPBA)
1.9 铁蛋白研究进展
1.10 本研究的目的和意义
第二章 兔铁蛋白重链截短基因的克隆及序列分析
2.1 材料
2.1.1 实验动物与病毒
2.1.2 菌株及载体
2.1.3 酶及主要试剂
2.2 方法
2.2.1 基因扩增的策略
2.2.2 扩增引物的设计
2.2.3 细胞总RNA的提取
2.2.4 重组质粒的构建
2.2.5 克隆质粒的提取与测序鉴定
2.2.6 表达载体的构建
2.2.7 重组蛋白的表达
2.2.8 重组蛋白的纯化
2.3 结果
2.3.1 序列分析及表达载体的鉴定
2.3.2 FTH截短重组蛋白表达纯化
2.4 讨论
第三章 兔铁蛋白重链与RHDV相互作用位点的鉴定
3.1 材料和方法
3.1.1 质粒、毒株及菌株
3.1.2 主要化学试剂
3.1.3 主要设备
3.1.4 诱饵载体pGBKT7-X的构建及鉴定
3.1.5 捕获载体pGBKT7-Y的构建及鉴定
3.1.6 捕获载体pGADT7-Y的自激活检测和毒性检测
3.1.7 pGBKT7-X与pGADT7-Y共转化酵母菌AH109
3.1.8 ELISA验证FTH截短重组蛋白与RHDV具有相互作用
3.1.9 FTH截短重组蛋白中和RHDV的血凝试验
3.2 结果
3.2.1 RHDV病毒蛋白基因的扩增
3.2.2 诱饵载体pGBKT7-X的构建及鉴定
3.2.3 诱饵载体pGBKT7-X的毒性检测分析
3.2.4 诱饵载体pGBKT7-X的自激活检测分析
3.2.5 捕获载体pGADT7-Y的构建及鉴定
3.2.6 捕获载体pGADT7-Y的自激活和毒性检测
3.2.7 酵母双杂交验证结果
3.2.8 ELISA验证结果
3.2.9 血凝活性实验验证结果
3.3 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
附录
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]ELISA验证兔铁蛋白重链与RHDV VP60相互作用[J]. 孙宏勇,刘家森,王泽祥,陈淑慧,单丽玲,郭冬春,姜骞,林欢,曲连东. 中国预防兽医学报. 2013(09)
[2]兔出血症病毒衣壳蛋白与次级结构蛋白的相互作用[J]. 杨宗伟,倪征,云涛,陈宗艳,李传峰,刘光清. 科学通报. 2012(24)
[3]表达克隆技术在蛋白质相互作用研究中的应用[J]. 柳迪,唐丽,贺福初. 细胞与分子免疫学杂志. 2012(08)
[4]兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选[J]. 穆亚芳,刘家森,郭东春,李茂中,原冬伟,姜骞,林欢,曲连东. 中国预防兽医学报. 2011(05)
[5]兔病毒性出血症研究进展[J]. 汤少伟. 上海畜牧兽医通讯. 2010(05)
[6]酵母双杂交技术研究与应用进展[J]. 李先昆,聂智毅,曾日中. 安徽农业科学. 2009(07)
[7]TaqMan MGB探针实时检测兔病毒性出血症病毒[J]. 张秀娥,田夫林,李希友,李建亮,崔言顺. 中国兽医学报. 2007(06)
[8]遗传性酪氨酸血症Ⅰ型10例的临床诊断分析[J]. 李晓瑜,杜敏联,庄思齐,莫恩明,马华梅,李燕虹,陈红珊,丘小汕. 中华儿科杂志. 2006(06)
[9]与接头蛋白Bam32相互作用的蛋白分子的鉴定[J]. 程小星,蹇锐. 细胞与分子免疫学杂志. 2005(04)
[10]人肝癌组织中p53与HSP70相互作用的初步研究[J]. 崔崇伟,杨守京,刘雁平,刘彦仿. 细胞与分子免疫学杂志. 2003(02)
硕士论文
[1]兔铁蛋白重链与兔出血症病毒相互作用的研究[D]. 孙宏勇.中国农业科学院 2013
[2]人工感染兔出血症病毒兔肝脏的蛋白质组学分析[D]. 李茂中.中国农业科学院 2012
[3]兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定[D]. 穆亚芳.中国农业科学院 2011
本文编号：3318841
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