基于猪基因组位点特异性重组的RNA干扰载体的构建及抗口蹄疫病毒细胞模型的建立
发布时间：2021-08-03 04:53
RNA干扰技术（RNAi）是通过小的RNA分子（miRNA、siRNA、shRNA）实现抑制靶基因的表达。因其易操作性，RNAi在某些领域逐步取代同源打靶技术，成为研究基因功能的重要工具。miRNA及siRNA主要用于瞬时抑制目标基因的表达，检测基因功能。shRNA与hU6启动子、U6终止子相结合构成shRNA表达元件，主要用于构建具有稳定抑制作用的工程细胞系。目前应用比较成熟的shRNA表达元件的递呈系统主要有质粒载体和病毒（腺病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒等）载体。质粒载体整合效率极低，且靶位随机；病毒载体虽然转染效率较高，但其插入位点随机，给基因的后续定位带来困难并存在潜在的危害，因此，病毒载体不适于转基因动物的商品化应用。打靶载体因其特异性位点插入功能从而成为转基因动物目的基因递呈系统的研究热点。由于RNAi技术的不断成熟、基因功能研究的不断突破，为转基因动物研究过程中对病原或宿主基因进行合理干扰抑制成为可能。本文将打靶载体与RNAi技术相结合，为转基因动物的生产奠定了基础。本实验通过对猪的基因组进行分析，针对猪β3基因中的内含子区域设计两对扩增引物，分别用于扩增同源重组所需要...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
病毒基因组结构、裂解位点及病毒粒子构像
图 1.2 简单同源重组机制Figure 1.2 Simple Gene Replacement源打靶技术实施的工具，打靶载体的最基本组件包括同源重组臂重组效率较低，在实际应用过程中往往引入正负筛选标记基因，广泛使用的正筛选标记基因包括：嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶基因因（NEO），潮霉素磷酸转移酶基因（hph），杀稻瘟菌素脱氨酶基核糖转移基因（gpt）。经常使用的负筛选标记有两种，即：单纯疱毒素A片段（DTA）（Alexandra L. Joyner, 2000）。记往往有两个目的：1. 筛选整合有外源基因的转染细胞；2. 在正插入新的编码基因或者是缺失已经存在的基因序列）。引入负筛选获得载体基因的工程细胞诱导死亡。由于载体的线性化对于打靶合载体具有决定性的影响，因此在设计替换载体时，需要设计一切位点用于质粒转染前的线性化。同源臂外的非替换区域上在同源含子区域，或者是替换内含子区域的部分区段并不一定会破坏基因此，针对不同的目的，所选择的突变或者是整合区域会有所不以及序列与基因组序列的一致性对于同源打靶的效率有着较大的的最适长度为 5~10 kb。尽管选择更长的同源臂可以提高同源重组
图 1.3 Cre/loxP 与 Flp/FRT 特异删除位点序列特征Figure 3 sequence fearue of Cre/loxP and Flp/FRT deleting system1.6 核酸进入细胞核的递呈系统1.6.1 核显微注射技术核显微注射技术就是通过极细的针头将核酸直接注入目的细胞的细胞核中，低（<1%），代价昂贵。为了得到几个成功的转基因胚胎，往往需要对成千上万的微注射。同时随机插入导致的多样化表达，也是制约该技术使用的一个因素。虽约，核显微注射技术仍然在转基因牛、羊以及猪的培育中得到成功应用（J. M. R1.6.2 病毒载体递呈技术1974 年，Jaenisch 和Mintz首先使用SV40 病毒载体将外源DNA携带入囊胚中莫洛尼白血病病毒可以在胚胎着床前将病毒DNA插入动物基因组（R. Jaenisch, et进了反转录病毒载体在外源DNA插入机体基因组的使用。一些病毒载体具有较大使得载体的承载能力较强，如：慢病毒可以承载至少三个额外的基因。一个典型括独立的载体以及组装载体，其中独立的病毒载体用于携带目的基因，组装质粒
【参考文献】：
期刊论文
[1]沙门菌载体重组疫苗的研究进展[J]. 马延滨,高闪电,丛国正,常惠芸. 中国兽医杂志. 2011(06)
[2]双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定[J]. 李军华,韩翠芹,邓捷,王华岩. 生物工程学报. 2010(12)
本文编号：3318972
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
病毒基因组结构、裂解位点及病毒粒子构像
图 1.2 简单同源重组机制Figure 1.2 Simple Gene Replacement源打靶技术实施的工具，打靶载体的最基本组件包括同源重组臂重组效率较低，在实际应用过程中往往引入正负筛选标记基因，广泛使用的正筛选标记基因包括：嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶基因因（NEO），潮霉素磷酸转移酶基因（hph），杀稻瘟菌素脱氨酶基核糖转移基因（gpt）。经常使用的负筛选标记有两种，即：单纯疱毒素A片段（DTA）（Alexandra L. Joyner, 2000）。记往往有两个目的：1. 筛选整合有外源基因的转染细胞；2. 在正插入新的编码基因或者是缺失已经存在的基因序列）。引入负筛选获得载体基因的工程细胞诱导死亡。由于载体的线性化对于打靶合载体具有决定性的影响，因此在设计替换载体时，需要设计一切位点用于质粒转染前的线性化。同源臂外的非替换区域上在同源含子区域，或者是替换内含子区域的部分区段并不一定会破坏基因此，针对不同的目的，所选择的突变或者是整合区域会有所不以及序列与基因组序列的一致性对于同源打靶的效率有着较大的的最适长度为 5~10 kb。尽管选择更长的同源臂可以提高同源重组
图 1.3 Cre/loxP 与 Flp/FRT 特异删除位点序列特征Figure 3 sequence fearue of Cre/loxP and Flp/FRT deleting system1.6 核酸进入细胞核的递呈系统1.6.1 核显微注射技术核显微注射技术就是通过极细的针头将核酸直接注入目的细胞的细胞核中，低（<1%），代价昂贵。为了得到几个成功的转基因胚胎，往往需要对成千上万的微注射。同时随机插入导致的多样化表达，也是制约该技术使用的一个因素。虽约，核显微注射技术仍然在转基因牛、羊以及猪的培育中得到成功应用（J. M. R1.6.2 病毒载体递呈技术1974 年，Jaenisch 和Mintz首先使用SV40 病毒载体将外源DNA携带入囊胚中莫洛尼白血病病毒可以在胚胎着床前将病毒DNA插入动物基因组（R. Jaenisch, et进了反转录病毒载体在外源DNA插入机体基因组的使用。一些病毒载体具有较大使得载体的承载能力较强，如：慢病毒可以承载至少三个额外的基因。一个典型括独立的载体以及组装载体，其中独立的病毒载体用于携带目的基因，组装质粒
【参考文献】：
期刊论文
[1]沙门菌载体重组疫苗的研究进展[J]. 马延滨,高闪电,丛国正,常惠芸. 中国兽医杂志. 2011(06)
[2]双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定[J]. 李军华,韩翠芹,邓捷,王华岩. 生物工程学报. 2010(12)
本文编号：3318972
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