基于CRISPR/Cas9的抗猪瘟病毒猪的制备
发布时间：2021-08-03 09:46
猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种疾病,它给养猪业造成了巨大的经济损失。多年来,许多政府和人们针对猪瘟病毒采取了多种清除措施,然而,这种疾病却依然顽强的存在并肆虐着。这使得开发出更加有效的抗病策略来消灭CSFV变得十分必要和紧迫。本研究以猪胎儿成纤维细胞为研究对象,首先对CRISPR/Cas9为基础的定点整合技术进行了优化和提高。接着,将抗病毒RNA干扰技术与CRISPR/Cas9为基础的定点整合技术相结合成功的获得了抗猪瘟病毒转基因猪。体内及体外的病毒感染结果证实该转基因猪对猪瘟病毒的复制和增殖具有一定的抑制能力,能显著减少猪瘟病毒对猪群的致死率。除此之外,本研究还通过CRISPR/Cas9为基础的定点突变技术探究了LamR基因定点突变对猪瘟病毒抵抗的影响,发现猪LamR基因的定点突变能够是猪的细胞有效的抵御猪瘟病毒的感染,并成功地获得了LamR基因精确点突变的基因编辑猪。综上,本研究证实了通过基因工程的手段可以赋予猪体一定的病毒抵御能力,为后续抗病育种以及抗病毒研究提供...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
CRISPR/Cas9在猪基因组Rosa26基因的靶位示意图
sgRNA 序列及对应 PAM 区序列如下表：靶基因的序列（5’—3’） PAM 区序列SgRNA91 GTGAGAGTTATCTGACCGTA AGGSgRNA89 CTTGGGCCTATGCTCAAGAT GGGSgRNA86 ATCTTGACTACCACTGCGAT TGG1.3.2 电转染体系的优化通过 BTX 公司的 ECM2001 电转仪对 PFF 细胞的电转条件进行优化，优化的目标为该电转仪的三个主要参数，即：电压、脉冲长度、脉冲次数。通过将EGFP 表达质粒按照不同的转染参数的组合进行电转染实验，并于转染 48h 后，通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪对 PFFs 的转染效率进行评估。最终，PFFs 细胞的转染效率提高至 96.45%，如图 1.2
图 1.3 多种细胞系的 EGFP 质粒电转荧光图；Fig1.3 The transfection efficiency of the pEGFP-N1 vector into the indicated cell lineswasanalysed via fluorescence microscopy.最后，本研究还证实了体外转录的 mRNA 及 siRNA 也可通过该电转染体系实现高效的转染，结果见图 1.4。这些结果暗示了该电转染体系的多能性，为后续不同细胞中基因功能的研究提供了保障。
本文编号：3319401
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
CRISPR/Cas9在猪基因组Rosa26基因的靶位示意图
sgRNA 序列及对应 PAM 区序列如下表：靶基因的序列（5’—3’） PAM 区序列SgRNA91 GTGAGAGTTATCTGACCGTA AGGSgRNA89 CTTGGGCCTATGCTCAAGAT GGGSgRNA86 ATCTTGACTACCACTGCGAT TGG1.3.2 电转染体系的优化通过 BTX 公司的 ECM2001 电转仪对 PFF 细胞的电转条件进行优化，优化的目标为该电转仪的三个主要参数，即：电压、脉冲长度、脉冲次数。通过将EGFP 表达质粒按照不同的转染参数的组合进行电转染实验，并于转染 48h 后，通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪对 PFFs 的转染效率进行评估。最终，PFFs 细胞的转染效率提高至 96.45%，如图 1.2
图 1.3 多种细胞系的 EGFP 质粒电转荧光图；Fig1.3 The transfection efficiency of the pEGFP-N1 vector into the indicated cell lineswasanalysed via fluorescence microscopy.最后，本研究还证实了体外转录的 mRNA 及 siRNA 也可通过该电转染体系实现高效的转染，结果见图 1.4。这些结果暗示了该电转染体系的多能性，为后续不同细胞中基因功能的研究提供了保障。
本文编号：3319401
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