秦川牛PPARGC1A基因功能验证及遗传变异研究
发布时间：2021-08-03 10:34
过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1alpha, PPARGC1A or PGC-1α）,编码基因为PPARGC1A,作为转录共激活因子可以与一系列的转录因子相互作用,参与多种代谢途径,如适应性产热、线粒体的生物合成、葡萄糖代谢、肝脏糖异生、脂肪酸p氧化、脂肪细胞分化、肌肉类型转换等。在动物遗传育种中,由于PPARGC1A参与机体能量平衡和脂肪代谢调控的相关过程,PPARGC1A基因被作为影响动物产乳特性、肉质品质和动物生长的侯选基因加以研究,目前未发现该基因在中国地方黄牛品种中的相关研究。为此本研究利用基因克隆,腺病毒载体构建,细胞培养,qPCR,荧光素酶活性测定,DNA池测序,PCR-SSCP及PCR-RFLP等技术开展了秦川牛PPARGC1A基因的克隆,腺病毒介导的过表达和干扰技术对该基因的表达调控,及其在调控线粒体氧化呼吸链相关基因和肌肉细胞增殖分化相关基因的功能验证,启动子区的克隆及核心启动区的筛选分析,基因遗传变异的扫描及其与生长性状的关联分析等工...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 PPARGC1A基因研究进展
1.1.1 PPARGC1A基因结构
1.1.2 PPARGC1A基因的生理功能
1.1.3 PPARGC1A基因在人类中的多态性研究
1.1.4 PPARGC1A基因在畜禽上的研究进展
1.2 腺病毒载体的研究进展
1.2.1 腺病毒生物学特性
1.2.2 腺病毒载体的发展
1.3 展望
第二章 秦川牛PPARGC1A基因克隆、过表达腺病毒载体的构建及功能验证
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料与主要试剂
2.1.2 引物设计
2.1.3 RNA的提取和cDNA的合成
2.1.4 秦川牛PPARGC1A基因CDS区克隆
2.1.5 pGMT-PPARGC1A载体构建
2.1.6 pAdTrack-CMV-PPARGC1A载体的构建
2.1.7 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A载体的构建
2.1.8 腺病毒Ad-PPARGC1A的包装
2.1.9 腺病毒Ad-PPARGC1A的收获及扩增
2.1.10 腺病毒Ad-PPARGC1A滴度的测定
2.1.11 最佳MOI(Multiplicity of Infection)的确定
2.1.12 PPARGC1A基因过表达对牛肌肉细胞代谢和分化基因表达的影响
2.2 结果与分析
2.2.1 RNA提取
2.2.2 秦川牛PPARGC1A基因CDS区克隆及pGMT-PPARGC1A载体构建
2.2.3 pAdTrack-CMV-PPARGC1A载体的构建
2.2.4 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A载体的构建
2.2.5 腺病毒Ad-PPARGC1A的包装
2.2.6 腺病毒Ad-PPARGC1A的扩增及滴度测定
2.2.7 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定
2.2.8 PPARGC1A基因过表达后对牛肌肉细胞代谢和分化相关基因的影响
2.3 讨论
2.3.1 腺病毒介导的基因过表达
2.3.2 PPARGC1A基因过表达对牛肌肉细胞相关基因的影响
2.4 小结
第三章 秦川牛PPARGC1A基因干扰腺病毒载体的构建及功能验证
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料与主要试剂
3.1.2 靶向PPARGC1A基因的shRNAs干扰序列的设计及合成
3.1.3 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs载体的构建
3.1.4 pDsRed1-C1-PPARGC1A表达载体的构建
3.1.5 有效shRNAs序列的筛选
3.1.6 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重组腺病毒载体的构建及鉴定
3.1.7 腺病毒的包装、扩增及滴度测定
3.1.8 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定
3.1.9 PPARGC1A基因沉默后对肌肉细胞代谢和分化相关基因表达的影响
3.2 结果与分析
3.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs载体的构建
3.2.2 pDsRed1-C1-PPARGC1A载体的构建
3.2.3 有效shRNAs序列的筛选
3.2.4 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重组腺病毒骨架载体的构建
3.2.5 腺病毒的包装、扩增及滴度测定
3.2.6 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定
3.2.7 PPARGC1A基因沉默后对肌肉细胞代谢和分化相关基因表达的影响
3.3 讨论
3.3.1 腺病毒载体介导的RNAi
3.3.2 干扰腺病毒对牛肌肉细胞代谢和增殖分化相关基因的影响
3.4 小结
第四章 秦川牛PPARGC1A基因启动子区的克隆及活性研究
4.1 材料与方法
4.1.1 试验材料与主要试剂
4.1.2 引物设计与合成
4.1.3 秦川牛全血DNA的提取
4.1.4 秦川牛PPARGC1A基因启动子区全长扩增
4.1.5 pGMT-Promoter载体的构建
4.1.6 pGL3-Basic-Promoter不同截短载体的构建
4.1.7 pRL-TK和pGL3-Control载体的扩增与纯化
4.1.8 HEK293和C2C12细胞的培养
4.1.9 pGL3-Basic-Promoter重组系列质粒与对照质粒pR-TK共转染HEK293和C2C12细胞
4.1.10 荧光素酶活性检测
4.2 结果与分析
4.2.1 秦川牛PPARGC1A基因启动子区全长扩增
4.2.2 pGMT-Promoter载体的构建
4.2.3 pGL3-Basic-Promoter不同截短载体的构建
4.2.4 荧光素酶活性检测
4.3 讨论
4.3.1 秦川牛PPARGC1A基因启动子活性在HEK293及C2C12细胞系中的差异
4.3.2 秦川牛PPARGC1A基因启动子不同截短体的活性差异
4.4 小结
第五章 牛PPARGC1A基因遗传变异及其与生长性状的关联分析
5.1 材料与方法
5.1.1 实验动物与主要试剂
5.1.2 血液样品中基因组DNA提取
5.1.3 引物设计及PCR反应
5.1.4 利用DNA池技术扫描SNPs
5.1.5 利用PCR-SSCP和PCR-RFLP检测突变在群体中的分布规律
5.1.6 数据统计分析模型
5.2 结果与分析
5.2.1 牛血液样品中基因组DNA的提取
5.2.2 PCR扩增结果
5.2.3 DNA池扫描SNPs
5.2.4 不同SNPs分型结果
5.2.5 PPARGC1A基因多态位点频率分布的群体遗传学分析
5.2.6 PPARGC1A基因SNPs与牛生长性状的关联分析
5.3 讨论
5.3.1 PPARGC1A基因多态性在中国地方牛品种与外国牛品种的比较
5.3.2 牛PPARGC1A基因多态性与生长性状之间的关联
5.4 小结
第六章 结论与创新点
6.1 结论
6.2 创新点
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]共激活因子PGC-1α的研究进展[J]. 李密杰,张春梅,蓝贤勇,雷初朝,陈宏. 中国牛业科学. 2012(04)
[2]猪PPARGC1A和CAPNS1基因多态性及其与肉质性状的关联性分析[J]. G.Gandolfi,晋大鹏. 中国畜牧兽医. 2011(10)
[3]中国荷斯坦奶牛PPARGC1A基因内含子9的SNP与产奶性状的相关分析[J]. 王杰,原清会,张明,曾长军,赖松家. 四川农业大学学报. 2010(02)
[4]猪PPARGC1A基因的遗传变异检测及与胴体性状的关联分析[J]. 韩雪蕾,刘榜,彭勇波,刘雪颖,张庆德. 华中农业大学学报. 2009(05)
[5]PPARGC1A基因Thr394Thr/Gly482Ser多态性与2型糖尿病的关联研究[J]. 苏燕,彭姝彬,李智琼,黄青阳. 遗传. 2008(03)
本文编号：3319468
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 PPARGC1A基因研究进展
1.1.1 PPARGC1A基因结构
1.1.2 PPARGC1A基因的生理功能
1.1.3 PPARGC1A基因在人类中的多态性研究
1.1.4 PPARGC1A基因在畜禽上的研究进展
1.2 腺病毒载体的研究进展
1.2.1 腺病毒生物学特性
1.2.2 腺病毒载体的发展
1.3 展望
第二章 秦川牛PPARGC1A基因克隆、过表达腺病毒载体的构建及功能验证
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料与主要试剂
2.1.2 引物设计
2.1.3 RNA的提取和cDNA的合成
2.1.4 秦川牛PPARGC1A基因CDS区克隆
2.1.5 pGMT-PPARGC1A载体构建
2.1.6 pAdTrack-CMV-PPARGC1A载体的构建
2.1.7 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A载体的构建
2.1.8 腺病毒Ad-PPARGC1A的包装
2.1.9 腺病毒Ad-PPARGC1A的收获及扩增
2.1.10 腺病毒Ad-PPARGC1A滴度的测定
2.1.11 最佳MOI(Multiplicity of Infection)的确定
2.1.12 PPARGC1A基因过表达对牛肌肉细胞代谢和分化基因表达的影响
2.2 结果与分析
2.2.1 RNA提取
2.2.2 秦川牛PPARGC1A基因CDS区克隆及pGMT-PPARGC1A载体构建
2.2.3 pAdTrack-CMV-PPARGC1A载体的构建
2.2.4 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A载体的构建
2.2.5 腺病毒Ad-PPARGC1A的包装
2.2.6 腺病毒Ad-PPARGC1A的扩增及滴度测定
2.2.7 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定
2.2.8 PPARGC1A基因过表达后对牛肌肉细胞代谢和分化相关基因的影响
2.3 讨论
2.3.1 腺病毒介导的基因过表达
2.3.2 PPARGC1A基因过表达对牛肌肉细胞相关基因的影响
2.4 小结
第三章 秦川牛PPARGC1A基因干扰腺病毒载体的构建及功能验证
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料与主要试剂
3.1.2 靶向PPARGC1A基因的shRNAs干扰序列的设计及合成
3.1.3 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs载体的构建
3.1.4 pDsRed1-C1-PPARGC1A表达载体的构建
3.1.5 有效shRNAs序列的筛选
3.1.6 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重组腺病毒载体的构建及鉴定
3.1.7 腺病毒的包装、扩增及滴度测定
3.1.8 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定
3.1.9 PPARGC1A基因沉默后对肌肉细胞代谢和分化相关基因表达的影响
3.2 结果与分析
3.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs载体的构建
3.2.2 pDsRed1-C1-PPARGC1A载体的构建
3.2.3 有效shRNAs序列的筛选
3.2.4 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重组腺病毒骨架载体的构建
3.2.5 腺病毒的包装、扩增及滴度测定
3.2.6 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定
3.2.7 PPARGC1A基因沉默后对肌肉细胞代谢和分化相关基因表达的影响
3.3 讨论
3.3.1 腺病毒载体介导的RNAi
3.3.2 干扰腺病毒对牛肌肉细胞代谢和增殖分化相关基因的影响
3.4 小结
第四章 秦川牛PPARGC1A基因启动子区的克隆及活性研究
4.1 材料与方法
4.1.1 试验材料与主要试剂
4.1.2 引物设计与合成
4.1.3 秦川牛全血DNA的提取
4.1.4 秦川牛PPARGC1A基因启动子区全长扩增
4.1.5 pGMT-Promoter载体的构建
4.1.6 pGL3-Basic-Promoter不同截短载体的构建
4.1.7 pRL-TK和pGL3-Control载体的扩增与纯化
4.1.8 HEK293和C2C12细胞的培养
4.1.9 pGL3-Basic-Promoter重组系列质粒与对照质粒pR-TK共转染HEK293和C2C12细胞
4.1.10 荧光素酶活性检测
4.2 结果与分析
4.2.1 秦川牛PPARGC1A基因启动子区全长扩增
4.2.2 pGMT-Promoter载体的构建
4.2.3 pGL3-Basic-Promoter不同截短载体的构建
4.2.4 荧光素酶活性检测
4.3 讨论
4.3.1 秦川牛PPARGC1A基因启动子活性在HEK293及C2C12细胞系中的差异
4.3.2 秦川牛PPARGC1A基因启动子不同截短体的活性差异
4.4 小结
第五章 牛PPARGC1A基因遗传变异及其与生长性状的关联分析
5.1 材料与方法
5.1.1 实验动物与主要试剂
5.1.2 血液样品中基因组DNA提取
5.1.3 引物设计及PCR反应
5.1.4 利用DNA池技术扫描SNPs
5.1.5 利用PCR-SSCP和PCR-RFLP检测突变在群体中的分布规律
5.1.6 数据统计分析模型
5.2 结果与分析
5.2.1 牛血液样品中基因组DNA的提取
5.2.2 PCR扩增结果
5.2.3 DNA池扫描SNPs
5.2.4 不同SNPs分型结果
5.2.5 PPARGC1A基因多态位点频率分布的群体遗传学分析
5.2.6 PPARGC1A基因SNPs与牛生长性状的关联分析
5.3 讨论
5.3.1 PPARGC1A基因多态性在中国地方牛品种与外国牛品种的比较
5.3.2 牛PPARGC1A基因多态性与生长性状之间的关联
5.4 小结
第六章 结论与创新点
6.1 结论
6.2 创新点
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]共激活因子PGC-1α的研究进展[J]. 李密杰,张春梅,蓝贤勇,雷初朝,陈宏. 中国牛业科学. 2012(04)
[2]猪PPARGC1A和CAPNS1基因多态性及其与肉质性状的关联性分析[J]. G.Gandolfi,晋大鹏. 中国畜牧兽医. 2011(10)
[3]中国荷斯坦奶牛PPARGC1A基因内含子9的SNP与产奶性状的相关分析[J]. 王杰,原清会,张明,曾长军,赖松家. 四川农业大学学报. 2010(02)
[4]猪PPARGC1A基因的遗传变异检测及与胴体性状的关联分析[J]. 韩雪蕾,刘榜,彭勇波,刘雪颖,张庆德. 华中农业大学学报. 2009(05)
[5]PPARGC1A基因Thr394Thr/Gly482Ser多态性与2型糖尿病的关联研究[J]. 苏燕,彭姝彬,李智琼,黄青阳. 遗传. 2008(03)
本文编号：3319468
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3319468.html
