猪源副流感病毒5型分离、鉴定及其遗传进化分析
发布时间：2021-08-05 12:57
副流感病毒5型（PIV5）是一种不分节段的单股负链RNA病毒,属副黏病毒科、腮腺炎病毒属。其广泛存在于自然界,人和多种动物均可感染。据报道,PIV5在猪群中有较高的感染率,但相关的病原学、分子生物学及遗传进化分析等研究较少。鉴于此,本研究对本实验室保存的腹泻猪小肠组织样品进行病原分离,并对分离到的PIV5毒株进行F基因、全长基因组遗传进化分析及致病性研究,旨在为其诊断、防控及后期疫苗研究提供基础数据。利用Vero E6细胞通过盲传方法进行病毒分离,成功分离出5株副黏病毒。将分离到的病毒置于电镜下观察,发现副黏病毒样颗粒。5株毒株均可使鸡红细胞发生凝集,其血凝性能被鸡新城疫标准阳性血清抑制。进一步使用二代测序及RT-PCR方法对其进行鉴定,分析结果表明这5株毒株均为猪源PIV5毒株,分别被命名为HLJ2015/DP1-1/PIV5、HLJ2015/DP2-1/PIV5、SH/2015/122/PIV5、HuB/YC/2015/PIV5和JX/2015/1221/PIV5。为明确PIV5遗传变异情况,对5株猪源PIV5毒株F基因进行扩增与测序,对序列进行遗传进化分析。而后选择PIV5 SH...
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PIV5分离毒株感染VeroE6细胞CPE观察Fig2-1CytopathogeniceffectsonVeroE6cellsinfectwithPIV5isolationstrain
猪源副流感病毒5型分离、鉴定及其遗传进化分析182.3.2病毒鉴定结果2.3.2.1电镜观察结果为对分离病毒进行鉴定，待病毒于细胞内增殖至细胞出现CPE后，将培养基与细胞重复冻融3次，离心留取上清。病毒经梯度离心后于透射电镜下观察。如图2-2所示，镜下观察发现直径约为100~200nm的病毒粒子。病毒外被囊膜，形态及大小均与副黏病毒相似。初步证实所分离病毒为PIV5。2.3.2.2血凝及血凝抑制试验结果血凝及血凝抑制试验结果显示，5份样品的病毒液对鸡红细胞具有凝集作用。并且其对鸡红细胞的血凝活性可被鸡新城疫阳性标准血清特异性抑制。血凝及血凝抑制结果如表2-7所示。表2-7血凝及血凝抑制结果Table2-7Resultsofhemagglutinationandhemagglutinationinhibitiontest2.3.2.3二代测序结果为进一步对分离毒株进行鉴定，使用Illumina二代测序方法对5株副黏病毒进行序列分析。对测序得到的病毒原始序列进行处理，通过使用NCBIBLASTn和BLASTx非还原蛋白数据库（http://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）比对。其结果显示5株分离株序列与副黏病毒中副流感病毒5型高度一致，证实所分离病毒为PIV5。序列结果见附录。毒株名HLJ2015/DP1-1/PIV5HLJ2015/DP2-1/PIV5SH/2015/122/PIV5HuB/YC/2015/PIV5JX/2015/1221/PIV5血凝效价2424252525血凝抑制价2626262525图2-2PIV5分离毒株病毒粒子电镜观察结果Fig2-2ElectronmicrographofPIV5isolationstrain
PIV5毒株分离及鉴定192.3.3PIV5PCR检测结果使用特异性引物对5株PIV5分离毒株F基因进行扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳鉴定结果显示扩增产物为长度1748bp目的片段，5份样品均扩增出目的条带，且与预期大小相符（图2-3）。2.4讨论分离鉴定是病毒生物学特性研究的基础，常见的实验室病毒分离多采用细胞培养传代的方法，这就要求敏感细胞系的选择。目前，PIV5广泛存在于自然界，可于大量细胞系中增殖。但被感染细胞一般不出现CPE，这样的特性使得PIV5的病毒分离难度增加。1998年，Heinen等于一只流产仔猪肺脏中成功分离一株副流感病毒毒株，将该病毒接种细胞后，镜下观察细胞出现显著CPE，随后该病毒被证实为PIV5毒株（PIV5SER）[104]。2013年，一株猪源PIV5KNU-11毒株于韩国被分离，Lee等经过研究发现该毒株于猪肺泡巨噬细胞（PAM）内培养可使细胞出现CPE。但与SER毒株不同，KNU-11可于细胞内引发更加严重和急剧的CPE现象，具体表现为感染细胞圆聚和皱缩。对两株毒株的敏感细胞系进行比较发现，在Vero细胞、牛肾细胞（MDBK）及仓鼠肾传代细胞（BHK-21）中，SER毒株均可正常进行复制，KNU-11毒株则不能。SER毒株仅可于个别细胞系中引发轻微CPE，图2-3PIV5F基因PCR鉴定结果Fig2-3TheidentificationforPIV5FgenebyPCRM.DL2000DNAMarker；1.空白对照；2-6.PIV5F基因阳性扩增产物（1748bp）LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1.Blankcontrol;Lane2-6.AmplificationproductsofPIV5Fgene(1748bp)2000bp1748bp750bp500bp250bp100bpM1234561000bp
【参考文献】：
期刊论文
[1]首例兽用活疫苗中污染副流感病毒5型的检测[J]. 吴华伟,秦义娴,陈晓春,曹明慧,林梓栋,邓永,刘丹. 中国兽药杂志. 2018(12)
[2]副流感病毒5型载体研究进展[J]. 高菽蔓,靳红亮,张守峰,扈荣良. 中国兽医学报. 2016(08)
[3]副流感病毒5型的分子生物学研究进展[J]. 高菽蔓,靳红亮,马嫄,扈荣良. 中国动物传染病学报. 2016(02)
[4]猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用[J]. 冯育芳,李晓波,邢进,付瑞,王吉,卫礼,岳秉飞,贺争鸣. 中国比较医学杂志. 2013(10)
[5]猴副流感病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 吴凡,贺争鸣,邢瑞昌. 实验动物科学. 2007(03)
[6]猴副流感病毒SV5 PCR检测方法的建立与初步应用[J]. 于浩,蒋虹,佟巍,丛喆,孙敏,冯育芳,王卫,涂新明,魏强. 中国实验动物学报. 2006(01)
[7]副粘病毒附着蛋白在病毒融合过程中的作用[J]. 王恩秀,于明,高福,田波. 微生物学通报. 2002(03)
本文编号：3323792
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PIV5分离毒株感染VeroE6细胞CPE观察Fig2-1CytopathogeniceffectsonVeroE6cellsinfectwithPIV5isolationstrain
猪源副流感病毒5型分离、鉴定及其遗传进化分析182.3.2病毒鉴定结果2.3.2.1电镜观察结果为对分离病毒进行鉴定，待病毒于细胞内增殖至细胞出现CPE后，将培养基与细胞重复冻融3次，离心留取上清。病毒经梯度离心后于透射电镜下观察。如图2-2所示，镜下观察发现直径约为100~200nm的病毒粒子。病毒外被囊膜，形态及大小均与副黏病毒相似。初步证实所分离病毒为PIV5。2.3.2.2血凝及血凝抑制试验结果血凝及血凝抑制试验结果显示，5份样品的病毒液对鸡红细胞具有凝集作用。并且其对鸡红细胞的血凝活性可被鸡新城疫阳性标准血清特异性抑制。血凝及血凝抑制结果如表2-7所示。表2-7血凝及血凝抑制结果Table2-7Resultsofhemagglutinationandhemagglutinationinhibitiontest2.3.2.3二代测序结果为进一步对分离毒株进行鉴定，使用Illumina二代测序方法对5株副黏病毒进行序列分析。对测序得到的病毒原始序列进行处理，通过使用NCBIBLASTn和BLASTx非还原蛋白数据库（http://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）比对。其结果显示5株分离株序列与副黏病毒中副流感病毒5型高度一致，证实所分离病毒为PIV5。序列结果见附录。毒株名HLJ2015/DP1-1/PIV5HLJ2015/DP2-1/PIV5SH/2015/122/PIV5HuB/YC/2015/PIV5JX/2015/1221/PIV5血凝效价2424252525血凝抑制价2626262525图2-2PIV5分离毒株病毒粒子电镜观察结果Fig2-2ElectronmicrographofPIV5isolationstrain
PIV5毒株分离及鉴定192.3.3PIV5PCR检测结果使用特异性引物对5株PIV5分离毒株F基因进行扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳鉴定结果显示扩增产物为长度1748bp目的片段，5份样品均扩增出目的条带，且与预期大小相符（图2-3）。2.4讨论分离鉴定是病毒生物学特性研究的基础，常见的实验室病毒分离多采用细胞培养传代的方法，这就要求敏感细胞系的选择。目前，PIV5广泛存在于自然界，可于大量细胞系中增殖。但被感染细胞一般不出现CPE，这样的特性使得PIV5的病毒分离难度增加。1998年，Heinen等于一只流产仔猪肺脏中成功分离一株副流感病毒毒株，将该病毒接种细胞后，镜下观察细胞出现显著CPE，随后该病毒被证实为PIV5毒株（PIV5SER）[104]。2013年，一株猪源PIV5KNU-11毒株于韩国被分离，Lee等经过研究发现该毒株于猪肺泡巨噬细胞（PAM）内培养可使细胞出现CPE。但与SER毒株不同，KNU-11可于细胞内引发更加严重和急剧的CPE现象，具体表现为感染细胞圆聚和皱缩。对两株毒株的敏感细胞系进行比较发现，在Vero细胞、牛肾细胞（MDBK）及仓鼠肾传代细胞（BHK-21）中，SER毒株均可正常进行复制，KNU-11毒株则不能。SER毒株仅可于个别细胞系中引发轻微CPE，图2-3PIV5F基因PCR鉴定结果Fig2-3TheidentificationforPIV5FgenebyPCRM.DL2000DNAMarker；1.空白对照；2-6.PIV5F基因阳性扩增产物（1748bp）LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1.Blankcontrol;Lane2-6.AmplificationproductsofPIV5Fgene(1748bp)2000bp1748bp750bp500bp250bp100bpM1234561000bp
【参考文献】：
期刊论文
[1]首例兽用活疫苗中污染副流感病毒5型的检测[J]. 吴华伟,秦义娴,陈晓春,曹明慧,林梓栋,邓永,刘丹. 中国兽药杂志. 2018(12)
[2]副流感病毒5型载体研究进展[J]. 高菽蔓,靳红亮,张守峰,扈荣良. 中国兽医学报. 2016(08)
[3]副流感病毒5型的分子生物学研究进展[J]. 高菽蔓,靳红亮,马嫄,扈荣良. 中国动物传染病学报. 2016(02)
[4]猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用[J]. 冯育芳,李晓波,邢进,付瑞,王吉,卫礼,岳秉飞,贺争鸣. 中国比较医学杂志. 2013(10)
[5]猴副流感病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 吴凡,贺争鸣,邢瑞昌. 实验动物科学. 2007(03)
[6]猴副流感病毒SV5 PCR检测方法的建立与初步应用[J]. 于浩,蒋虹,佟巍,丛喆,孙敏,冯育芳,王卫,涂新明,魏强. 中国实验动物学报. 2006(01)
[7]副粘病毒附着蛋白在病毒融合过程中的作用[J]. 王恩秀,于明,高福,田波. 微生物学通报. 2002(03)
本文编号：3323792
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