苜蓿皂苷对BRL肝细胞LDLR、LXR、FXR表达的影响及pNTAP-LDLR的构建与表达
发布时间：2021-08-06 19:13
近年来,随着人们生活水平的提高,高血脂、动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管疾病已成为危害人类身体健康的头号杀手。血脂异常,特别是血液中过高的胆固醇含量是引发这些疾病的主要因素之一。因此,控制高脂血症的发生对于预防心脑血管疾病有着重要意义。苜蓿皂苷具有调节脂质代谢,降低机体胆固醇含量等作用,但是目前对其机理研究并不多,特别是细胞水平上的研究更少。为了研究苜蓿皂苷在细胞水平上对胆固醇代谢的作用,试验一以大鼠BRL肝细胞为研究对象研究苜蓿皂苷对细胞胆固醇代谢相关基因的影响；试验二构建胆固醇代谢关键基因-低密度脂蛋白受体（LDLR）的串联亲和纯化载体并在293T细胞中表达。具体情况如下：试验一苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞基因表达的影响。1、将培养2d的BRL正常细胞随机分为4组,正常细胞对照A组、正常细胞+苜蓿皂苷50 mg/L B组、正常细胞+苜蓿皂苷100mg/LC组和正常细胞+苜蓿皂苷150mg/LD组。正常BRL细胞分组后培养24 h,加入不同浓度的苜蓿皂苷液,继续培养24 h后,收集细胞,运用qRT-PCR检测细胞内LDLR、LXR（肝X受体）和FXR（胆汁酸受体）mRNA的表达。2、采用...
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
1 文献综述
1.1 苜蓿皂苷降低机体胆固醇的作用及其机理研究进展
1.1.1 苜蓿皂苷结构
1.1.2 苜蓿皂苷的理化特征
1.1.3 苜蓿皂苷的主要生物学活性
1.1.3.1 苜蓿皂苷具有溶血作用
1.1.3.2 苜蓿皂苷具有增加免疫、抗氧化作用
1.1.3.3 苜蓿皂苷具有抗菌消炎作用
1.1.3.4 苜蓿皂苷具有调节脂质代谢,降低胆固醇的作用
1.1.3.5 苜蓿皂苷的其它作用
1.1.4 苜蓿皂苷降低机体胆固醇的分子机理研究
1.1.4.1 苜蓿皂苷影响胆固醇的吸收和合成,减少机体胆固醇的来源
1.1.4.2 苜蓿皂苷加速胆汁酸的排泄,影响肝肠循环
1.1.4.3 苜蓿皂苷促进LDL受体、非受体途径的代谢
1.1.4.4 苜蓿皂苷影响胆固醇的转运
1.2 低密度脂蛋白受体及其调节机制研究进展
1.2.1 LDLR的结构和功能
1.2.2 LDLR的调节机制
1.2.2.1 LDLR的胆固醇依赖的调节机制
1.2.2.2 LDLR的非胆固醇依赖的调节机制
1.2.3 影响LDLR mRNA表达调控的因素
1.2.3.1 HMG-CoA还原酶抑制剂
1.2.3.2 激素
1.2.3.3 胆固醇
1.2.3.4 植物提取物
1.2.3.5 其他因素
1.3 展望
2 引言
3 试验一 苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞基因表达的影响
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 主要试剂和仪器
3.1.3 细胞培养前的准备工作
3.1.4 细胞培养、传代、冻存和复苏
3.1.4.1 细胞培养与传代
3.1.4.2 细胞冻存
3.1.4.3 细胞复苏
3.1.5 细胞计数
3.1.6 BRL大鼠肝细胞的培养
3.2 指标测定与方法
3.2.1 MTT法测定苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞活性的影响
3.2.1.1 MTT溶液的配制
3.2.1.2 细胞活性的测定方法
3.2.2 mRNA相对表达量测定
3.2.2.1 大鼠BRL肝细胞总RNA的提取
3.2.2.2 RNA浓度的测定
3.2.2.3 总RNA的质量检测
3.2.2.4 RNA反转录过程
3.2.2.5 引物设计与合成
3.2.2.6 荧光定量PCR
3.2.2.7 统计分析
3.3 结果与分析
3.3.1 MTT法检测苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞增殖活性的影响
3.3.2 苜蓿皂苷对正常和脂变大鼠BRL肝细胞LDLR mRNA表达量的影响
3.3.3 苜蓿皂苷对正常和脂变大鼠BRL肝细胞LXRα mRNA表达量的影响
3.3.4 苜蓿皂苷对正常和脂变大鼠BRL肝细胞FXR mRNA表达量的影响
3.4 讨论
3.4.1 MTT法检测苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞活性的影响
3.4.2 苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞LDLR mRNA表达量的影响
3.4.3 苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞LXRα mRNA表达量的影响
3.4.4 苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞FXR mRNA表达量的影响
3.5 小结
4 试验二 重组质粒pNTAP-LDLR的构建及表达
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要试剂和仪器
4.1.3 主要溶液的配制
4.2 指标测定与方法
4.2.1 LDLR基因的扩增和T-A克隆
4.2.1.1 大鼠肝脏总RNA提取
4.2.1.2 RNA浓度的测定：同试验一
4.2.1.3 总RNA的质量检测：同试验一
4.2.1.4 RNA反转录过程：同试验一
4.2.1.5 引物设计与合成
4.2.1.6 LDLR片段的扩增和纯化回收
4.2.1.7 LDLR基因T-A克隆
4.2.2 重组载体的构建和鉴定
4.2.2.1 重组载体的构建
4.2.2.2 重组载体的酶切鉴定
4.2.3 重组质粒转染HEK-293T检测目的蛋白表达
4.2.3.1 293T细胞的培养
4.2.3.3 Western blotting检测LDLR蛋白的表达
4.3 结果
4.3.1 总RNA提取
4.3.2 LDLR基因扩增
4.3.3 PCR产物T-A克隆菌落PCR鉴定及测序鉴定
4.3.4 pNTAP-LDLR串联亲和表达载体的构建和酶切鉴定
4.3.5 pNTAP-LDLR串联亲和表达载体测序鉴定
4.3.6 Western blot检测分析
4.4 讨论
4.5 小结
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
英文摘要
【参考文献】：
期刊论文
[1]苜蓿皂苷对高脂血症大鼠胆固醇代谢及其相关基因表达的影响[J]. 王先科,史莹华,王成章,陈明亮,袁德地. 动物营养学报. 2012(05)
[2]苜蓿皂苷对断奶仔猪脂质代谢、抗氧化和免疫的影响[J]. 王成章,王彦华,史莹华,严学兵,何云,樊文娜. 草业学报. 2011(04)
[3]小檗碱对高脂血症兔脂代谢及肝脏LDLR和SR-B1基因表达的影响[J]. 金磊,何琦,周岐新,杨俊霞. 中国生物制品学杂志. 2010(11)
[4]高胆固醇膳食对大鼠和仓鼠肝脏HMG-CoA-R、LDL-R蛋白和基因表达的影响[J]. 王浩,张泽生,张颖,温生萍,左艳博,凌洁. 食品研究与开发. 2010(10)
[5]苜蓿皂甙对断奶仔猪生长性能和抗氧化性能的影响[J]. 史莹华,王成章,徐兵,王先科,陈明亮,袁德地. 草地学报. 2010(05)
[6]三七总皂甙对脂肪变性L02肝细胞TG含量及LXRα mRNA表达的影响[J]. 程少冰,杨钦河,张玉佩,杨环文,谢芳,薛川松,欧健. 中国病理生理杂志. 2010(06)
[7]大豆异黄酮对去卵巢大鼠LXRα表达影响[J]. 张锋,万忠晓,张玉梅. 中国公共卫生. 2010(02)
[8]苜蓿皂苷对断奶仔猪生产性能、消化率及血液生化指标的影响[J]. 王彦华,王成章,高永革,严学兵,史莹华,何云. 草业学报. 2009(05)
[9]肝X受体的研究进展[J]. 王强,江渝. 生理科学进展. 2009(02)
[10]低密度脂蛋白受体及其调节机制研究进展[J]. 张锐,张绍芬. 国外医学(老年医学分册). 2009(01)
博士论文
[1]姜黄素对肝细胞LDLR表达作用的分子机理研究[D]. 窦晓兵.北京中医药大学 2007
硕士论文
[1]用TAP系统筛选与Pygopus-2相互作用蛋白的初步研究[D]. 张毓纯.厦门大学 2008
[2]苜蓿皂甙在产蛋鸡及蛋雏鸡饲粮中的应用研究[D]. 潘俊良.河南农业大学 2007
[3]苜蓿皂甙和草粉对断奶仔猪和肥育猪生产性能的影响及其机理研究[D]. 王彦华.河南农业大学 2007
本文编号：3326328
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
1 文献综述
1.1 苜蓿皂苷降低机体胆固醇的作用及其机理研究进展
1.1.1 苜蓿皂苷结构
1.1.2 苜蓿皂苷的理化特征
1.1.3 苜蓿皂苷的主要生物学活性
1.1.3.1 苜蓿皂苷具有溶血作用
1.1.3.2 苜蓿皂苷具有增加免疫、抗氧化作用
1.1.3.3 苜蓿皂苷具有抗菌消炎作用
1.1.3.4 苜蓿皂苷具有调节脂质代谢,降低胆固醇的作用
1.1.3.5 苜蓿皂苷的其它作用
1.1.4 苜蓿皂苷降低机体胆固醇的分子机理研究
1.1.4.1 苜蓿皂苷影响胆固醇的吸收和合成,减少机体胆固醇的来源
1.1.4.2 苜蓿皂苷加速胆汁酸的排泄,影响肝肠循环
1.1.4.3 苜蓿皂苷促进LDL受体、非受体途径的代谢
1.1.4.4 苜蓿皂苷影响胆固醇的转运
1.2 低密度脂蛋白受体及其调节机制研究进展
1.2.1 LDLR的结构和功能
1.2.2 LDLR的调节机制
1.2.2.1 LDLR的胆固醇依赖的调节机制
1.2.2.2 LDLR的非胆固醇依赖的调节机制
1.2.3 影响LDLR mRNA表达调控的因素
1.2.3.1 HMG-CoA还原酶抑制剂
1.2.3.2 激素
1.2.3.3 胆固醇
1.2.3.4 植物提取物
1.2.3.5 其他因素
1.3 展望
2 引言
3 试验一 苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞基因表达的影响
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 主要试剂和仪器
3.1.3 细胞培养前的准备工作
3.1.4 细胞培养、传代、冻存和复苏
3.1.4.1 细胞培养与传代
3.1.4.2 细胞冻存
3.1.4.3 细胞复苏
3.1.5 细胞计数
3.1.6 BRL大鼠肝细胞的培养
3.2 指标测定与方法
3.2.1 MTT法测定苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞活性的影响
3.2.1.1 MTT溶液的配制
3.2.1.2 细胞活性的测定方法
3.2.2 mRNA相对表达量测定
3.2.2.1 大鼠BRL肝细胞总RNA的提取
3.2.2.2 RNA浓度的测定
3.2.2.3 总RNA的质量检测
3.2.2.4 RNA反转录过程
3.2.2.5 引物设计与合成
3.2.2.6 荧光定量PCR
3.2.2.7 统计分析
3.3 结果与分析
3.3.1 MTT法检测苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞增殖活性的影响
3.3.2 苜蓿皂苷对正常和脂变大鼠BRL肝细胞LDLR mRNA表达量的影响
3.3.3 苜蓿皂苷对正常和脂变大鼠BRL肝细胞LXRα mRNA表达量的影响
3.3.4 苜蓿皂苷对正常和脂变大鼠BRL肝细胞FXR mRNA表达量的影响
3.4 讨论
3.4.1 MTT法检测苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞活性的影响
3.4.2 苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞LDLR mRNA表达量的影响
3.4.3 苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞LXRα mRNA表达量的影响
3.4.4 苜蓿皂苷对大鼠BRL肝细胞FXR mRNA表达量的影响
3.5 小结
4 试验二 重组质粒pNTAP-LDLR的构建及表达
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要试剂和仪器
4.1.3 主要溶液的配制
4.2 指标测定与方法
4.2.1 LDLR基因的扩增和T-A克隆
4.2.1.1 大鼠肝脏总RNA提取
4.2.1.2 RNA浓度的测定：同试验一
4.2.1.3 总RNA的质量检测：同试验一
4.2.1.4 RNA反转录过程：同试验一
4.2.1.5 引物设计与合成
4.2.1.6 LDLR片段的扩增和纯化回收
4.2.1.7 LDLR基因T-A克隆
4.2.2 重组载体的构建和鉴定
4.2.2.1 重组载体的构建
4.2.2.2 重组载体的酶切鉴定
4.2.3 重组质粒转染HEK-293T检测目的蛋白表达
4.2.3.1 293T细胞的培养
4.2.3.3 Western blotting检测LDLR蛋白的表达
4.3 结果
4.3.1 总RNA提取
4.3.2 LDLR基因扩增
4.3.3 PCR产物T-A克隆菌落PCR鉴定及测序鉴定
4.3.4 pNTAP-LDLR串联亲和表达载体的构建和酶切鉴定
4.3.5 pNTAP-LDLR串联亲和表达载体测序鉴定
4.3.6 Western blot检测分析
4.4 讨论
4.5 小结
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
英文摘要
【参考文献】：
期刊论文
[1]苜蓿皂苷对高脂血症大鼠胆固醇代谢及其相关基因表达的影响[J]. 王先科,史莹华,王成章,陈明亮,袁德地. 动物营养学报. 2012(05)
[2]苜蓿皂苷对断奶仔猪脂质代谢、抗氧化和免疫的影响[J]. 王成章,王彦华,史莹华,严学兵,何云,樊文娜. 草业学报. 2011(04)
[3]小檗碱对高脂血症兔脂代谢及肝脏LDLR和SR-B1基因表达的影响[J]. 金磊,何琦,周岐新,杨俊霞. 中国生物制品学杂志. 2010(11)
[4]高胆固醇膳食对大鼠和仓鼠肝脏HMG-CoA-R、LDL-R蛋白和基因表达的影响[J]. 王浩,张泽生,张颖,温生萍,左艳博,凌洁. 食品研究与开发. 2010(10)
[5]苜蓿皂甙对断奶仔猪生长性能和抗氧化性能的影响[J]. 史莹华,王成章,徐兵,王先科,陈明亮,袁德地. 草地学报. 2010(05)
[6]三七总皂甙对脂肪变性L02肝细胞TG含量及LXRα mRNA表达的影响[J]. 程少冰,杨钦河,张玉佩,杨环文,谢芳,薛川松,欧健. 中国病理生理杂志. 2010(06)
[7]大豆异黄酮对去卵巢大鼠LXRα表达影响[J]. 张锋,万忠晓,张玉梅. 中国公共卫生. 2010(02)
[8]苜蓿皂苷对断奶仔猪生产性能、消化率及血液生化指标的影响[J]. 王彦华,王成章,高永革,严学兵,史莹华,何云. 草业学报. 2009(05)
[9]肝X受体的研究进展[J]. 王强,江渝. 生理科学进展. 2009(02)
[10]低密度脂蛋白受体及其调节机制研究进展[J]. 张锐,张绍芬. 国外医学(老年医学分册). 2009(01)
博士论文
[1]姜黄素对肝细胞LDLR表达作用的分子机理研究[D]. 窦晓兵.北京中医药大学 2007
硕士论文
[1]用TAP系统筛选与Pygopus-2相互作用蛋白的初步研究[D]. 张毓纯.厦门大学 2008
[2]苜蓿皂甙在产蛋鸡及蛋雏鸡饲粮中的应用研究[D]. 潘俊良.河南农业大学 2007
[3]苜蓿皂甙和草粉对断奶仔猪和肥育猪生产性能的影响及其机理研究[D]. 王彦华.河南农业大学 2007
本文编号：3326328
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