非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立
发布时间：2021-08-07 07:02
本研究根据非洲猪瘟病毒（ASFV）B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪A型塞内卡病毒（SVA）等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×102copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(08)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
不同引物组合的PCR扩增结果
LFD-RPA特异性检测结果
酸和35份阴性核酸共50份临床样品核酸进行检测，以验证该法与荧光PCR法的符合率。2结果2.1引物的筛选对设计合成的3条正向引物和3条反向引物采用普通PCR法进行筛选，结果表明，9种引物组合均出现扩增条带，其中引物组合F1/R3扩增条带最清晰（图1），扩增片段大小约216bp，与预期相符，可用于后续试验。采用的引物及探针序列见表1。2.2LFD-RPA反应体系的建立设定反应温度分别为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，LFD-RPA检测结果显示，上述反应温度条件下均可观察到阳性检测线，其中39℃时条带颜色相对较清晰（图2），确定最佳反应条件为39℃孵育20min。2.3LFD-RPA特异性试验分别以重组质粒pUC-B646L以及ASFV、PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA核酸为模板进行LFD-RPA检测，结果（图3）显示，只有阳性质粒pUC-B646L和ASFVDNA检测线和控制线均出现条带，判为阳性；而其他核酸模板及阴性对照、水对照仅控制线有条带，检测线无条带，判为阴性。结果表明，所建立的方法可以特异性检测ASFVDNA，与PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA等病原核酸无交叉反应。2.4LFD-RPA灵敏度试验将重组质粒pUC-B646L进行10倍稀释，分别以10－3～10－9稀释度pUC-B646L为模板进行LFD-RPA检测，结果显示，所建立方法可检测的最低限为10－7稀释度，对应浓度为1.57×102copies/L（图4）；而实时荧光PCR法检测低限为10－9稀释度（图5），比所建立的LFD-RPA法灵敏度高100倍。2.5模拟样品及临床样品的核酸检测分别采用LFD-RPA和实时荧光PCR对24份模拟样品（18份阳性、6份阴性）进行检测，所建立的LFD-RPA方法检测结果与实时荧光PCR完全一致，可准确检测到其中18份模拟阳性样品。此外，用所建立方法对50份已知的临床样品核酸进行检测，?
【参考文献】：
期刊论文
[1]非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用[J]. 林彦星,曹琛福,曾少灵,花群俊,杨俊兴,黄超华,史卫军,花群义. 中国兽医科学. 2019(09)
[2]非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测方法的建立[J]. 哈登楚日亚,樊晓旭,赵永刚,王淑娟,张志诚,戈胜强,李林,吴晓东,王志亮. 中国畜牧兽医. 2017(11)
[3]非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立[J]. 李林,刘拂晓,樊晓旭,李金明,邹艳丽,刘珊,包静月,吴晓东,王志亮. 中国动物检疫. 2017(08)
[4]非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立[J]. 王建昌,王金凤,刘立兵,孙晓霞,袁万哲. 中国动物检疫. 2016(07)
本文编号：3327318
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(08)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
不同引物组合的PCR扩增结果
LFD-RPA特异性检测结果
酸和35份阴性核酸共50份临床样品核酸进行检测，以验证该法与荧光PCR法的符合率。2结果2.1引物的筛选对设计合成的3条正向引物和3条反向引物采用普通PCR法进行筛选，结果表明，9种引物组合均出现扩增条带，其中引物组合F1/R3扩增条带最清晰（图1），扩增片段大小约216bp，与预期相符，可用于后续试验。采用的引物及探针序列见表1。2.2LFD-RPA反应体系的建立设定反应温度分别为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，LFD-RPA检测结果显示，上述反应温度条件下均可观察到阳性检测线，其中39℃时条带颜色相对较清晰（图2），确定最佳反应条件为39℃孵育20min。2.3LFD-RPA特异性试验分别以重组质粒pUC-B646L以及ASFV、PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA核酸为模板进行LFD-RPA检测，结果（图3）显示，只有阳性质粒pUC-B646L和ASFVDNA检测线和控制线均出现条带，判为阳性；而其他核酸模板及阴性对照、水对照仅控制线有条带，检测线无条带，判为阴性。结果表明，所建立的方法可以特异性检测ASFVDNA，与PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA等病原核酸无交叉反应。2.4LFD-RPA灵敏度试验将重组质粒pUC-B646L进行10倍稀释，分别以10－3～10－9稀释度pUC-B646L为模板进行LFD-RPA检测，结果显示，所建立方法可检测的最低限为10－7稀释度，对应浓度为1.57×102copies/L（图4）；而实时荧光PCR法检测低限为10－9稀释度（图5），比所建立的LFD-RPA法灵敏度高100倍。2.5模拟样品及临床样品的核酸检测分别采用LFD-RPA和实时荧光PCR对24份模拟样品（18份阳性、6份阴性）进行检测，所建立的LFD-RPA方法检测结果与实时荧光PCR完全一致，可准确检测到其中18份模拟阳性样品。此外，用所建立方法对50份已知的临床样品核酸进行检测，?
【参考文献】：
期刊论文
[1]非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用[J]. 林彦星,曹琛福,曾少灵,花群俊,杨俊兴,黄超华,史卫军,花群义. 中国兽医科学. 2019(09)
[2]非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测方法的建立[J]. 哈登楚日亚,樊晓旭,赵永刚,王淑娟,张志诚,戈胜强,李林,吴晓东,王志亮. 中国畜牧兽医. 2017(11)
[3]非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立[J]. 李林,刘拂晓,樊晓旭,李金明,邹艳丽,刘珊,包静月,吴晓东,王志亮. 中国动物检疫. 2017(08)
[4]非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立[J]. 王建昌,王金凤,刘立兵,孙晓霞,袁万哲. 中国动物检疫. 2016(07)
本文编号：3327318
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