碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

发布时间：2021-08-08 23:05

　　本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3 072 bp处的单核苷酸多态性（SNP）位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染... 

【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(11)北大核心

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

sgRNA-IGF2表达载体测序结果

本研究共使用rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器[6](图1)。在传统的rA1-BE3中,rA1、Cas9和UGI三者之间通过连接肽进行串联,并利用CMV启动子表达该融合蛋白。hA3A-BE3使用人源胞嘧啶脱氨酶hA3A替换rA1;hA3A-BE3-Y130F的hA3A中存在第130位的酪氨酸(Tyr)到苯丙氨酸(Phe)的氨基酸突变;hA3A-eBE-Y130F相对于hA3A-BE3-Y130F,利用P2A融合肽,额外表达3个游离的UGI。1.1.2 主要试剂

pGL3-U6-sgRNA载体包含U6启动子转录表达的sgRNA骨架,通过将Bsa Ⅰ线性化的pGL3-U6-sgRNA载体与靶向巴马猪IGF2基因的sgRNA Oligo进行重组,对构建的sgRNA-IGF2质粒进行Sanger测序,结果显示,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间(图4)。图3 IGF2基因位点碱基编辑示意图

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3330851