miR-224、miR-146b、miR-215和miR-135a 对脂肪细胞分化和脂质代谢的作用研究

发布时间：2021-08-10 02:08

　　近年来,大量的研究表明miRNA在脂肪细胞分化和脂质代谢方面起着重要的调控作用,miRNA通过靶向脂肪生成的重要转录因子和脂质代谢关键基因调控脂肪细胞分化和脂质代谢。本论文基于5月龄大白猪和梅山猪的背部脂肪组织Solexa测序获得的差异表达的miRNAs,通过对miRNAs的序列分析、靶基因预测和功能分析等,靶定miR-224、miR-146b、miR-215和miR-135a。采用双荧素酶报告基因检测、Q-PCR、Western blotting等方法对4个miRNAs的作用和功能进行了研究,主要研究结果如下：1. miR-224调控脂肪细胞分化和脂肪酸代谢经UCSC网站比对发现,包括猪在内的多种哺乳动物的miR-224定位在X染色体上的相同的位置,即GABRE基因的内含子处；通过对miR-224的前体序列和成熟序列进行比对,它们在哺乳动物中的序列高度保守。通过多种靶基因预测软件预测发现,EGR2和ACSL4可能是miR-224的靶基因。双荧光素酶报告试验证实,与对照组相比, miR-224-5p明显抑制了EGR2-3’UTR和ACSL4-3’UTR双荧光素酶报告载体的荧光活性。在3... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：135 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩写对照表
第一章 文献综述
    1 引言
    2 脂肪生成概述
        2.1 脂肪生成过程
        2.2 调控脂肪生成的重要转录因子
            2.2.1 PPAR家族
            2.2.2 C/EBPs家族
        2.3 TGFβ信号通路与脂肪生成
        2.4 Wnt信号通路与脂肪生成
    3 脂质代谢
        3.1 脂肪酸的β-氧化
            3.1.1 脂肪酸的活化
            3.1.2 脂酰CoA进入线粒体
            3.1.3 脂肪酸的β-氧化
        3.2 脂肪酸碳链的延长
    4 miRNA调控脂肪细胞分化和脂质代谢
        4.1 miRNA的生物合成和作用机制
        4.2 miRNA主要检测方法
            4.2.1 传统的克隆方法
            4.2.2 Northern blotting杂交
            4.2.3 miRNA芯片
            4.2.4 Q-PCR(real time quantitative PCR)
            4.2.5 高通量测序
        4.3 miRNA调控脂肪细胞分化
            4.3.1 miRNA促进脂肪细胞分化
            4.3.2 miRNA抑制脂肪细胞分化
        4.4 miRNA调控脂质代谢
    5 问题的提出及课题的目的与意义
第二章 miR-224对脂肪细胞分化和脂肪酸代谢的作用研究
    1 材料与方法
        1.1 载体和菌株
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 主要溶液的配制
        1.4 细胞培养及诱导分化
            1.4.1. 细胞的复苏
            1.4.2 细胞的常规培养
            1.4.3 细胞冻存
            1.4.4 3T3-L1细胞的诱导分化
        1.5 细胞转染及双荧光素酶活性的测定
            1.5.1 细胞的转染
            1.5.2 荧光素酶相对活性的检测
        1.6 细胞总RNA的提取
        1.7 Q-PCR分析
            1.7.1 miRNA的定量分析
            1.7.2 基因的定量分析
        1.8 油红O染色
        1.9 甘油三酯和游离脂肪酸含量测定
        1.10 靶基因预测以及预测靶基因3'UTR双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建
            1.10.1 靶基因预测
            1.10.2 预测靶基因3'UTR双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建
        1.11 靶基因的鉴定
        1.12 Western blotting分析
            1.12.1 蛋白提取
            1.12.2 SDS-PAGE电泳
            1.12.3 转膜
            1.12.4 抗原抗体免疫反应
            1.12.5 抗体
        1.13 主要数据库及分析软件
        1.14 统计学分析
    2 结果与分析
        2.1 miR-224序列保守性分析
        2.2 miR-224-5p的表达谱分析
        2.3 miR-224-5p抑制小鼠3T3-L1前脂肪细胞的分化
        2.4 miR-224靶基因的鉴定
        2.5 miR-224-5p在脂肪细胞分化早期抑制脂肪细胞的分化
        2.6 miR-224-5p调节脂肪酸代谢
        2.7 讨论
            2.7.1 miR-224的序列分析和表达谱分析
            2.7.2 miR-224调控脂肪细胞分化
            2.7.3 miR-224调控脂肪酸代谢
第三章 miR-146b在脂肪细胞分化过程中的作用研究
    1 材料与方法
    2 结果与分析
        2.1 miR-146b序列保守性分析
        2.2 miR-146b-5p的表达谱分析
        2.3 miR-146b-5p促进3T3-L1前脂肪细胞的分化
        2.4 miR-146b靶基因的鉴定
        2.5 miR-146-5p通过靶向Runx1t1和Smad4促进脂肪细胞的分化
        2.6 讨论
            2.6.1 miR-146b的序列分析
            2.6.2 miR-146b调控脂肪细胞分化
第四章 miR-215在脂肪细胞分化过程中的作用研究
    1 材料与方法
    2 结果与分析
        2.1 miR-215序列保守性分析
        2.2 miR-215-5p抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化
        2.3 miR-215靶基因的鉴定
        2.4 miR-215-5p通过靶向FNDC3B和CTNNBIP1抑制脂肪细胞的分化
        2.5 讨论
            2.5.1 miR-215的序列分析
            2.5.2 miR-215调控脂肪细胞分化
第五章 miR-135a调控脂肪酸碳链的延长
    1 材料与方法
    2 结果与分析
        2.1 miR-135a序列保守性分析
        2.2 miR-135a靶基因的鉴定
        2.3 讨论
第六章 讨论
    1 miRNA的保守性
    2 miRNA靶基因预测
    3 miRNA调控脂肪生成和脂质代谢
    4 主要创新点
    5 不足之处
    6 下一步工作计划
参考文献
附录Ⅰ
研究生在读期间发表的主要论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]动物中microRNA的保守性和进化历程[J]. 罗艳,张群,梁宇君,张士璀.  中国科学:生命科学. 2012(02)
[2]编码极长链脂肪酸延长酶基因家族的结构及其产物的功能[J]. 王海燕,苏玉虹.  生命的化学. 2005(01)



本文编号：3333238