表达猪GM-CSF重组PRRSV弱毒疫苗株的构建及其免疫特性分析
发布时间：2021-08-10 04:22
猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）,是引起母猪繁殖障碍和仔猪出现呼吸道疾病的重要病原。该病毒感染后,能够破坏免疫细胞,延迟宿主产生中和抗体和细胞免疫应答,造成免疫抑制,对养猪业危害极大。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）,是一种具有多项潜能的造血生长因子,能够促进树突状细胞分化和成熟,进而增强其抗原递呈能力。为提高我国目前现有高致病性PRRSV弱毒疫苗的免疫效果,本研究在高致病性PRRSV（HP-PRRSV）弱毒疫苗株HuN4-F112感染性分子克隆的基础上,利用融合PCR的方法,将猪源GM-CSF基因序列,引入到弱毒疫苗株HuN4-F112基因组ORF1b和ORF2a之间,最终获得了表达GM-CSF的重组PRRSV,并在体内外进行了重组病毒的生物学特性分析。在试验中,首先构建了重组表达载体pHuN4-F112-GM-CSF;为确保GM-CSF基因在PRRSV中的遗传稳定性,我们在GM-CSF基因后插入PRRSV ORF6的转录调控序列（TRS6）,构建了pHuN4-F...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 猪繁殖与呼吸综合征
1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒
1.2.1 病毒的结构蛋白及其功能
1.2.2 病毒的非结构蛋白及其功能
1.2.3 病毒的细胞嗜性
1.3 PRRSV的免疫应答和持续性感染
1.3.1 先天性免疫和病毒持续感染
1.3.2 获得性免疫
1.3.2.1 体液免疫
1.3.2.2 细胞免疫
1.4 PRRSV疫苗
1.4.1 现有疫苗及问题
1.4.2 PRRSV新型疫苗
1.4.2.1 细胞因子作为免疫佐剂
1.4.2.2 化学试剂作为免疫佐剂
1.4.2.3 细菌代谢产物
1.5 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的功能及应用
1.5.1 GM-CSF
1.5.2 GM-CSF在T细胞免疫调节中的作用
1.5.3 GM-CSF在抗肿瘤免疫中的作用
1.5.4 GM-CSF作为疫苗佐剂的应用
1.6 研究目的及意义
第二章 表达猪源GM-CSF重组PRRS病毒的构建
摘要
2.1 材料和方法
2.1.1 病毒株、细胞和载体
2.1.2 主要仪器
2.1.3 含有GM-CSF重组PRRSV感染性分子克隆的构建
2.1.4 pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF-TRS6和pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF质粒的构建
2.1.4.1 引物设计
2.1.4.2 利用融合PCR方法构建重组质粒的具体实施步骤
2.1.5 含有GM-CSF的重组PRRSV的拯救
2.1.5.1 重组PRRSV全长cDNA的构建
2.1.5.2 重组PRRSV全长cDNA的线性化
2.1.5.3 重组PRRSV线性化cDNA的体外转录
2.1.5.4 重组病毒基因组RNA转染至BHK-21细胞
2.1.5.5 重组病毒的拯救和传代
2.1.6 含有GM-CSF的重组PRRSV的鉴定
2.1.6.1 RT-PCR鉴定和DNA测序分析
2.1.6.2 重组病毒分子标记的鉴定
2.1.6.3 间接免疫荧光(IFA)鉴定
2.1.6.4 Western blotting鉴定
2.1.7 含有GM-CSF的重组PRRSV的生物学特性分析
2.1.7.1 TCID50测定
2.1.7.2 病毒生长曲线绘制
2.1.7.3 重组病毒噬斑形成的形态分析
2.1.7.4 重组病毒的遗传稳定性分析
2.2 结果
2.2.1 重组病毒的细胞病变观察
2.2.2 重组病毒的MluI酶切鉴定
2.2.3 重组病毒的RT-PCR鉴定及测序分析
2.2.4 重组病毒表达GM-CSF蛋白的IFA鉴定
2.2.5 重组病毒表达pGM-CSF蛋白的Western blot鉴定
2.2.6 重组病毒的生物学特性分析
2.2.6.1 重组病毒的生长滴度测定
2.2.6.2 重组病毒噬斑形态分析
2.2.6.3 重组病毒的生长曲线的绘制
2.2.6.4 重组病毒的遗传稳定性分析
2.3 讨论
第三章 表达猪源GM-CSF的缺失重组PRRS病毒的构建
摘要
3.1 材料和方法
3.1.1 病毒株、细胞和载体
3.1.2 主要试剂
3.1.3 含有GM-CSF的缺失重组PRRSV感染性分子克隆的构建
3.1.4 含有GM-CSF的缺失重组PRRSV的拯救
3.1.4.1 缺失重组PRRSV全长cDNA的线性化
3.1.4.2 缺失重组PRRSV全长线性化cDNA的体外转录和转染
3.1.4.3 缺失重组病毒的拯救和传代
3.1.5 含有GM-CSF的缺失重组病毒的鉴定分析
3.1.5.1 RT-PCR和DNA测序鉴定
3.1.5.2 缺失重组病毒分子标记酶切鉴定
3.1.5.3 间接免疫荧光(IFA)鉴定分析
3.1.6 含有GM-CSF的缺失重组病毒生物学特性分析
3.1.6.1 缺失重组病毒的生长滴度测定
3.1.6.2 缺失重组病毒的生长曲线绘制
3.1.6.3 缺失重组病毒空斑形成的形态分析
3.1.6.4 缺失重组病毒的遗传稳定性分析
3.2 结果
3.2.1 缺失重组质粒全长的构建
3.2.2 缺失病毒的细胞病变观察
3.2.3 缺失病毒的分子标记酶切鉴定
3.2.4 RT-PCR鉴定和DNA测序分析
3.2.5 缺失病毒表达pGM-CSF蛋白的IFA鉴定
3.2.6 缺失病毒的生物学特性分析
3.2.6.1 生长滴度测定
3.2.6.2 病毒的生长动力学分析
3.2.6.3 病毒噬斑形态分析
3.2.6.4 缺失病毒的遗传稳定性分析
3.3 讨论
第四章 重组病毒体外促进骨髓源树突状细胞成熟和分化作用的研究
摘要
4.1 材料和方法
4.1.1 病毒株和细胞
4.1.2 主要仪器和试剂
4.1.3 猪骨髓细胞(BMHC)分离
4.1.4 猪骨髓源树突状细胞(BMDC)的培养
4.1.5 流式细胞术检测细胞表面分子表达
4.1.6 细胞因子检测
4.1.7 细胞因子mRNA水平检测
4.1.7.1 相对荧光定量PCR引物的设计
4.1.7.2 提取细胞总RNA
4.1.7.3 合成cDNA
4.1.7.4 实时荧光定量PCR
4.2 结果
4.2.1 表达GM-CSF的重组PRRSV对GM-CSF蛋白预刺激的BMHC的作用
4.2.2 表达GM-CSF的重组PRRSV直接对BMHC的刺激作用
4.2.3 细胞因子检测
4.2.4 细胞因子mRNA水平检测
4.3 讨论
第五章 重组病毒感染猪诱导的免疫特性分析
摘要
5.1 材料与方法
5.1.1 实验动物
5.1.2 细胞、病毒和病毒扩增
5.1.3 主要仪器
5.1.4 实验分组及免疫剂量
5.1.5 血清中PRRSV抗体水平检测
5.1.6 血清中病毒含量的测定
5.1.7 流式术检测免疫细胞的活化水平
5.2 结果
5.2.1 重组病毒免疫猪后的体温变化及临床观察
5.2.2 猪血清中PRRSV抗体检测结果
5.2.3 猪血清中病毒含量的检测结果
5.2.4 流式术分析外周血免疫细胞的变化
5.2.5 组织病理学检测结果
5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J]. 韦天超,田志军,安同庆,周艳君,肖燕,姜一峰,郝晓芳,张善瑞,彭金美,仇华吉,童光志. 中国预防兽医学报. 2008(12)
[2]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]. 童光志,周艳君,郝晓芳,田志军,仇华吉,彭金美,安同庆. 中国预防兽医学报. 2007(05)
[3]从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙. 中国畜禽传染病. 1996(02)
博士论文
[1]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒致弱毒株NSP2复制非必需区的鉴定及其表达外源基因的研究[D]. 徐彦召.中国农业科学院 2012
[2]表达免疫刺激因子的重组狂犬疫苗对狂犬病的暴露前及暴露后预防研究[D]. 王化磊.吉林大学 2010
本文编号：3333450
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 猪繁殖与呼吸综合征
1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒
1.2.1 病毒的结构蛋白及其功能
1.2.2 病毒的非结构蛋白及其功能
1.2.3 病毒的细胞嗜性
1.3 PRRSV的免疫应答和持续性感染
1.3.1 先天性免疫和病毒持续感染
1.3.2 获得性免疫
1.3.2.1 体液免疫
1.3.2.2 细胞免疫
1.4 PRRSV疫苗
1.4.1 现有疫苗及问题
1.4.2 PRRSV新型疫苗
1.4.2.1 细胞因子作为免疫佐剂
1.4.2.2 化学试剂作为免疫佐剂
1.4.2.3 细菌代谢产物
1.5 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的功能及应用
1.5.1 GM-CSF
1.5.2 GM-CSF在T细胞免疫调节中的作用
1.5.3 GM-CSF在抗肿瘤免疫中的作用
1.5.4 GM-CSF作为疫苗佐剂的应用
1.6 研究目的及意义
第二章 表达猪源GM-CSF重组PRRS病毒的构建
摘要
2.1 材料和方法
2.1.1 病毒株、细胞和载体
2.1.2 主要仪器
2.1.3 含有GM-CSF重组PRRSV感染性分子克隆的构建
2.1.4 pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF-TRS6和pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF质粒的构建
2.1.4.1 引物设计
2.1.4.2 利用融合PCR方法构建重组质粒的具体实施步骤
2.1.5 含有GM-CSF的重组PRRSV的拯救
2.1.5.1 重组PRRSV全长cDNA的构建
2.1.5.2 重组PRRSV全长cDNA的线性化
2.1.5.3 重组PRRSV线性化cDNA的体外转录
2.1.5.4 重组病毒基因组RNA转染至BHK-21细胞
2.1.5.5 重组病毒的拯救和传代
2.1.6 含有GM-CSF的重组PRRSV的鉴定
2.1.6.1 RT-PCR鉴定和DNA测序分析
2.1.6.2 重组病毒分子标记的鉴定
2.1.6.3 间接免疫荧光(IFA)鉴定
2.1.6.4 Western blotting鉴定
2.1.7 含有GM-CSF的重组PRRSV的生物学特性分析
2.1.7.1 TCID50测定
2.1.7.2 病毒生长曲线绘制
2.1.7.3 重组病毒噬斑形成的形态分析
2.1.7.4 重组病毒的遗传稳定性分析
2.2 结果
2.2.1 重组病毒的细胞病变观察
2.2.2 重组病毒的MluI酶切鉴定
2.2.3 重组病毒的RT-PCR鉴定及测序分析
2.2.4 重组病毒表达GM-CSF蛋白的IFA鉴定
2.2.5 重组病毒表达pGM-CSF蛋白的Western blot鉴定
2.2.6 重组病毒的生物学特性分析
2.2.6.1 重组病毒的生长滴度测定
2.2.6.2 重组病毒噬斑形态分析
2.2.6.3 重组病毒的生长曲线的绘制
2.2.6.4 重组病毒的遗传稳定性分析
2.3 讨论
第三章 表达猪源GM-CSF的缺失重组PRRS病毒的构建
摘要
3.1 材料和方法
3.1.1 病毒株、细胞和载体
3.1.2 主要试剂
3.1.3 含有GM-CSF的缺失重组PRRSV感染性分子克隆的构建
3.1.4 含有GM-CSF的缺失重组PRRSV的拯救
3.1.4.1 缺失重组PRRSV全长cDNA的线性化
3.1.4.2 缺失重组PRRSV全长线性化cDNA的体外转录和转染
3.1.4.3 缺失重组病毒的拯救和传代
3.1.5 含有GM-CSF的缺失重组病毒的鉴定分析
3.1.5.1 RT-PCR和DNA测序鉴定
3.1.5.2 缺失重组病毒分子标记酶切鉴定
3.1.5.3 间接免疫荧光(IFA)鉴定分析
3.1.6 含有GM-CSF的缺失重组病毒生物学特性分析
3.1.6.1 缺失重组病毒的生长滴度测定
3.1.6.2 缺失重组病毒的生长曲线绘制
3.1.6.3 缺失重组病毒空斑形成的形态分析
3.1.6.4 缺失重组病毒的遗传稳定性分析
3.2 结果
3.2.1 缺失重组质粒全长的构建
3.2.2 缺失病毒的细胞病变观察
3.2.3 缺失病毒的分子标记酶切鉴定
3.2.4 RT-PCR鉴定和DNA测序分析
3.2.5 缺失病毒表达pGM-CSF蛋白的IFA鉴定
3.2.6 缺失病毒的生物学特性分析
3.2.6.1 生长滴度测定
3.2.6.2 病毒的生长动力学分析
3.2.6.3 病毒噬斑形态分析
3.2.6.4 缺失病毒的遗传稳定性分析
3.3 讨论
第四章 重组病毒体外促进骨髓源树突状细胞成熟和分化作用的研究
摘要
4.1 材料和方法
4.1.1 病毒株和细胞
4.1.2 主要仪器和试剂
4.1.3 猪骨髓细胞(BMHC)分离
4.1.4 猪骨髓源树突状细胞(BMDC)的培养
4.1.5 流式细胞术检测细胞表面分子表达
4.1.6 细胞因子检测
4.1.7 细胞因子mRNA水平检测
4.1.7.1 相对荧光定量PCR引物的设计
4.1.7.2 提取细胞总RNA
4.1.7.3 合成cDNA
4.1.7.4 实时荧光定量PCR
4.2 结果
4.2.1 表达GM-CSF的重组PRRSV对GM-CSF蛋白预刺激的BMHC的作用
4.2.2 表达GM-CSF的重组PRRSV直接对BMHC的刺激作用
4.2.3 细胞因子检测
4.2.4 细胞因子mRNA水平检测
4.3 讨论
第五章 重组病毒感染猪诱导的免疫特性分析
摘要
5.1 材料与方法
5.1.1 实验动物
5.1.2 细胞、病毒和病毒扩增
5.1.3 主要仪器
5.1.4 实验分组及免疫剂量
5.1.5 血清中PRRSV抗体水平检测
5.1.6 血清中病毒含量的测定
5.1.7 流式术检测免疫细胞的活化水平
5.2 结果
5.2.1 重组病毒免疫猪后的体温变化及临床观察
5.2.2 猪血清中PRRSV抗体检测结果
5.2.3 猪血清中病毒含量的检测结果
5.2.4 流式术分析外周血免疫细胞的变化
5.2.5 组织病理学检测结果
5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J]. 韦天超,田志军,安同庆,周艳君,肖燕,姜一峰,郝晓芳,张善瑞,彭金美,仇华吉,童光志. 中国预防兽医学报. 2008(12)
[2]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]. 童光志,周艳君,郝晓芳,田志军,仇华吉,彭金美,安同庆. 中国预防兽医学报. 2007(05)
[3]从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙. 中国畜禽传染病. 1996(02)
博士论文
[1]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒致弱毒株NSP2复制非必需区的鉴定及其表达外源基因的研究[D]. 徐彦召.中国农业科学院 2012
[2]表达免疫刺激因子的重组狂犬疫苗对狂犬病的暴露前及暴露后预防研究[D]. 王化磊.吉林大学 2010
本文编号：3333450
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