新疆羊种布鲁氏菌分离株的鉴定与L7/L12蛋白的原核表达和生物信息学分析
发布时间：2021-08-11 05:49
【目的】分离并鉴定新疆羊种布鲁氏菌。原核表达该菌的L7/L12蛋白,检测该蛋白的反应原性及进行部分生物学分析。【方法】采用细菌划线培养、形态学观察、PCR检测以及生化试验进行布鲁氏菌分离鉴定。利用常规分子生物学方法表达并纯化羊种布鲁氏菌分离株的L7/L12蛋白,应用Western Blot分析融合蛋白的反应原性。使用生物信息学软件对该蛋白进行了生物信息学分析。【结果】分离鉴定确定该菌株为羊种布鲁氏菌。经过测序与酶切鉴定,正确构建了表达载体p ET-28a-L7/L12.SDS-PAGE试验显示纯化的L7/L12蛋白为单一条带;经过Western Blot检测,该融合蛋白具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。【结论】鉴定出该分离菌株,表达并纯化了该菌的L7/L12融合蛋白,Western Blot证明该蛋白具有良好的反应原性,为后续该蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。
【文章来源】：新疆农业科学. 2017,54(03)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
7/L12基因的扩增
晰，杂带较少，说明纯化效果较好(图5b)。图52．7重组蛋白L7/L12的反应原性检测将纯化后的重组蛋白L7/L12转至NC膜，采用羊布鲁菌阳性血清作为一抗，HＲP标记的兔抗羊抗体为二抗进行免疫印迹分析。WesternBlot结果显示在19ku的位置上有一条明显的特异性反应条带，表明融合蛋白能被抗布鲁氏菌的绵羊血清所识别，且目的蛋白具有良好的反应原性，与理论分析相符合。图61－2:纯化后的L7/L12蛋白;M:蛋白MarkerSDS－PAGEa-nalysistheeffectofpurifiedL7/L12fusionprotein1－2:thepurifiedL7/L12protein;M:ProteinMarker图5SDS－PAGE电泳检测L7/L12融合蛋白纯化效果Fig．5SDS－PAGEanalysistheeffectofpurifiedL7/L12fusionprotein1－3:纯化的His－L7/L12融合蛋白;M:蛋白Marker1－3:thepurifiedHis－L7/L12fusionprotein;M:ProteinMarker图6融合蛋白His－L7/L12WesternBlot分析Fig．6TheWesternBlotanalysisoffusionproteinHis－L7/L122．8目的蛋白的生物信息学通过TMHMMServerv．2.0在线软件分析得568
3期刘升等:新疆羊种布鲁氏菌分离株的鉴定与L7/L12蛋白的原核表达和生物信息学分析出，目的蛋白无跨膜螺旋结构(图7)。SignalP4.1Server对该蛋白氨基酸序列分析显示，该蛋白有信号肽(图8)。利用SOPMA在线软件分析该蛋白的二级结构，结果显示，85个氨基酸参与形成α－螺旋，占68.55%。延伸链占8.87%，有13个氨基酸参与形成β－折叠，占10.48%，无规卷曲结构占12.10%(图9)。通过Phyre2在线服务器构建出并优化目的蛋白的三维结构(图10)。利用PDBsumGenerate在线评估(图11)。从Ｒa-machandran图中可以看出，在121个氨基酸残基中，有98个处于核心允许区，占92.5%，6个处于额外允许区，占5.7%，1个处于最大允许区，占0.9%，不可信区域为1，占0.9%。这说明该模型具有一定的可信度。图7～11图7TMHMMServerv．2.0预测L7/L12蛋白跨膜结构域Fig．7ThepredictionoftransmembranedomainofL7/L12proteinbyTMHMMServerv．2.0图8SignalP4.1Server预测L7/L12蛋白信号肽Fig．8ThepredictionofsignalpeptideofL7/L12proteinbySignalP4.1Server569
【参考文献】：
期刊论文
[1]新疆动物布鲁氏菌病现状分析[J]. 闫晶华,李金平,米吉提,地里夏提,闫昊. 新疆畜牧业. 2011(10)
[2]新疆布鲁氏菌病疫情现状与防治对策[J]. 任德坤,常青,师茂林,李凡卡. 地方病通报. 2008(05)
[3]中国布鲁氏菌病疫情监测与控制[J]. 崔步云. 疾病监测. 2007(10)
[4]布鲁氏菌病再度肆虐及其原因[J]. 尚德秋. 中国地方病防治杂志. 2001(01)
博士论文
[1]流产布鲁氏菌Omp25与L7/L12促巨噬细胞凋亡的分子机制[D]. 曹涤非.东北农业大学 2012
本文编号：3335582
【文章来源】：新疆农业科学. 2017,54(03)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
7/L12基因的扩增
晰，杂带较少，说明纯化效果较好(图5b)。图52．7重组蛋白L7/L12的反应原性检测将纯化后的重组蛋白L7/L12转至NC膜，采用羊布鲁菌阳性血清作为一抗，HＲP标记的兔抗羊抗体为二抗进行免疫印迹分析。WesternBlot结果显示在19ku的位置上有一条明显的特异性反应条带，表明融合蛋白能被抗布鲁氏菌的绵羊血清所识别，且目的蛋白具有良好的反应原性，与理论分析相符合。图61－2:纯化后的L7/L12蛋白;M:蛋白MarkerSDS－PAGEa-nalysistheeffectofpurifiedL7/L12fusionprotein1－2:thepurifiedL7/L12protein;M:ProteinMarker图5SDS－PAGE电泳检测L7/L12融合蛋白纯化效果Fig．5SDS－PAGEanalysistheeffectofpurifiedL7/L12fusionprotein1－3:纯化的His－L7/L12融合蛋白;M:蛋白Marker1－3:thepurifiedHis－L7/L12fusionprotein;M:ProteinMarker图6融合蛋白His－L7/L12WesternBlot分析Fig．6TheWesternBlotanalysisoffusionproteinHis－L7/L122．8目的蛋白的生物信息学通过TMHMMServerv．2.0在线软件分析得568
3期刘升等:新疆羊种布鲁氏菌分离株的鉴定与L7/L12蛋白的原核表达和生物信息学分析出，目的蛋白无跨膜螺旋结构(图7)。SignalP4.1Server对该蛋白氨基酸序列分析显示，该蛋白有信号肽(图8)。利用SOPMA在线软件分析该蛋白的二级结构，结果显示，85个氨基酸参与形成α－螺旋，占68.55%。延伸链占8.87%，有13个氨基酸参与形成β－折叠，占10.48%，无规卷曲结构占12.10%(图9)。通过Phyre2在线服务器构建出并优化目的蛋白的三维结构(图10)。利用PDBsumGenerate在线评估(图11)。从Ｒa-machandran图中可以看出，在121个氨基酸残基中，有98个处于核心允许区，占92.5%，6个处于额外允许区，占5.7%，1个处于最大允许区，占0.9%，不可信区域为1，占0.9%。这说明该模型具有一定的可信度。图7～11图7TMHMMServerv．2.0预测L7/L12蛋白跨膜结构域Fig．7ThepredictionoftransmembranedomainofL7/L12proteinbyTMHMMServerv．2.0图8SignalP4.1Server预测L7/L12蛋白信号肽Fig．8ThepredictionofsignalpeptideofL7/L12proteinbySignalP4.1Server569
【参考文献】：
期刊论文
[1]新疆动物布鲁氏菌病现状分析[J]. 闫晶华,李金平,米吉提,地里夏提,闫昊. 新疆畜牧业. 2011(10)
[2]新疆布鲁氏菌病疫情现状与防治对策[J]. 任德坤,常青,师茂林,李凡卡. 地方病通报. 2008(05)
[3]中国布鲁氏菌病疫情监测与控制[J]. 崔步云. 疾病监测. 2007(10)
[4]布鲁氏菌病再度肆虐及其原因[J]. 尚德秋. 中国地方病防治杂志. 2001(01)
博士论文
[1]流产布鲁氏菌Omp25与L7/L12促巨噬细胞凋亡的分子机制[D]. 曹涤非.东北农业大学 2012
本文编号：3335582
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3335582.html
