猪卵泡抑素基因特异性表达载体的构建与表达
发布时间：2021-08-12 15:28
卵泡抑制素（follistatin, FST）是一种单链糖蛋白,也被称为卵泡休止素或者性激素抑制蛋白。它由单基因编码,编码区分为三个结构功能域,其中第一结构功能域与肌肉的生长有关,在高等动物几乎所有的组织中都有表达,具有广泛的生理作用。FST可以抑制转化生长因子（transforming growth factor, TGF）β超家族中的大部分成员蛋白的活性通过与其结合,从而有利于肌纤维发生广泛的肥大和增生。FST可与肌肉生长抑素（Myostatin）的C-端结合,抑制肌肉生长抑素跟受体结合,从而促进骨骼肌发育。本实验以民猪的FST基因为研究对象,采用克隆测序的方法得到FST基因的编码区。通过把骨骼肌特异性启动子a-actin和FST基因编码区插入到pEGFP-Cl载体中构建了可以在小鼠骨骼肌细胞中特异表达的pEGFP-Cl-α-actin-FST载体（P3载体）和pEGFP-Cl-CMV-a-actin-FST载体（P4载体）。Real-time PCR检测目的基因FST及其相关基因MYOD、 MYOG、MSTN、GDF11的相对表达量。本实验研究结果如下：（1）成功克隆了猪FST基...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 FST基因
1.1.1 FST基因结构特征
1.1.2 FST基因生物学功能
1.1.3 FST基因对肌肉生长的影响
1.1.4 FST基因与其他基因的互作研究
1.2 双启动子
1.3 实验目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物及细胞
2.1.2 实验试剂及耗材
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 主要药品的配制
2.1.5 主要生物学软件
2.1.6 实验相关生物信息学软件
2.2 实验方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 目的片段的亚克隆
2.2.3 真核表达载体的构建
2.2.4 细胞的培养
2.2.5 瞬时转染
2.2.6 双荧光素酶活性的测定
2.2.7 统计分析
2.2.8 细胞中总RNA的提取与反转录cDNA的合成
2.2.9 Real-time PCR的检测
3 结果与分析
3.1 猪FST基因的克隆与测序结果
3.1.1 FST基因编码区的PCR扩增结果
3.1.2 重组克隆质粒PMD18-T-FST的酶切鉴定
3.1.3 民猪FST基因编码区测序结果
3.2 α-actin的基因的克隆与测序结果
3.2.1 α-actin的PCR扩增结果
3.2.2 重组质粒pMD18-T-α-actin的酶切鉴定
3.2.3 α-actin测序结果
3.3 P1重组质粒双酶切鉴定结果
3.3.1 pGL3-basic质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果
3.3.2 P1重组质粒菌液PCR鉴定结果
3.3.3 P1重组质粒酶切鉴定结果
3.4 P2重组质粒双酶切鉴定结果
3.4.1 pEGFP-C1质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果
3.4.2 pEGFP-C1-CMV-α-actin菌液PCR鉴定结果
3.4.3 pEGFP-C1-CMV-α-actin重组质粒酶切鉴定结果
3.4.4 CMV-actin的克隆与测序结果
3.4.5 pGL3-basic质粒与pMD18-T-CMV-α-actin质粒的酶切结果
3.4.6 P2重组质粒菌液PCR鉴定结果
3.4.7 P2重组质粒酶切鉴定结果
3.5 双荧光素酶测定结果
3.5.1 C_2C_(12)细胞、PK15细胞的培养及转染效果
3.5.2 双荧光素酶活性检测结果
3.6 P3重组质粒酶切鉴定结果
3.6.1 pEGFP-C1质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果
3.6.2 pEGFP-C1-α-actin与pMD18-T-FST质粒的酶切结果
3.6.3 P3重组质粒菌液PCR鉴定结果
3.6.4 P3重组质粒酶切鉴定结果
3.7 P4重组质粒酶切鉴定结果
3.7.1 pEGFP-C1质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果
3.7.2 pEGFP-C1-CMV-α-actin与pMD18-T-FST质粒的酶切结果
3.7.3 P4重组质粒菌液PCR鉴定结果
3.7.4 P4重组质粒酶切鉴定结果
3.8 Real-time PCR的检测结果
3.8.1 从细胞中提取RNA的质量鉴定
3.8.2 FST基因及相关基因Real-time PCR的检测结果
4 讨论
4.1 载体构建
4.1.1 P1、P2重组质粒的构建
4.1.2 P3、P4重组质粒的构建
4.2 瞬时转染后细胞状态的观察
4.3 FST与MYOD、MYOG、MSTN、GDF11之间的互作分析
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]Myod1和Myog真核共表达载体构建及鉴定[J]. 高宏飞,梁炳生,双卫兵. 中国组织工程研究. 2013(37)
[2]猪MSTN基因的多态性和生长性状关联分析[J]. 刘晓琴,马喜山,唐中林,周荣,杨述林,敖红,牟玉莲,李奎. 畜牧兽医学报. 2013(07)
[3]锌指核酸酶技术制备肌肉生长抑制素基因敲除的五指山小型猪成纤维细胞[J]. 曹随忠,岳成鹤,李西睿,冯冲,龙川,潘登科. 遗传. 2013(06)
[4]卵泡抑素基因过表达对其通路上相关基因表达的影响[J]. 孙亚蒙,张冬杰,张旭,汪亮,解宇,刘娣. 中国畜牧兽医. 2013(05)
[5]MyoG和c-fos基因多态性及其合并基因型与猪肌纤维性状的关联分析[J]. 郭云雁,程笃学,张龙超,颜华,赵克斌,王立贤,刘文忠,郭慧慧,陈来华. 畜牧兽医学报. 2013(02)
[6]转卵泡抑制素基因对绵羊肌源性细胞中肌肉抑制素基因的调控[J]. 岳群华,袁建龙,郝斐,靳木子,王景园,杨文亮,刘东军,仓明. 中国农业科学. 2013(02)
[7]大黄鱼Follistatin基因克隆及表达分析[J]. 刘小飞,薛良义. 生物学杂志. 2012(06)
[8]肌肉特异性表达猪肌肉生长抑制素前肽载体的构建与验证[J]. 于永生,曹阳,罗晓彤,张树敏. 河北农业大学学报. 2012(06)
[9]绵羊Follistatin基因不同功能区片段的原核表达与纯化[J]. 阿米乃·亚日,冉多良,李文蓉,张宁. 中国草食动物科学. 2012(04)
[10]猪MyoD1基因多态性与肉质性状的相关分析[J]. 赵广珍,贾青,张翠翠,雷娜,冯安学,邢增喜. 河北农业大学学报. 2012(04)
硕士论文
[1]猪肌肉组织骨骼肌特异性基因α-actin启动子的克隆及功能验证[D]. 刘京鸽.华中农业大学 2010
[2]双启动子表达载体的构建以及酯酶B1基因的表达[D]. 张韩杰.山东农业大学 2004
本文编号：3338577
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 FST基因
1.1.1 FST基因结构特征
1.1.2 FST基因生物学功能
1.1.3 FST基因对肌肉生长的影响
1.1.4 FST基因与其他基因的互作研究
1.2 双启动子
1.3 实验目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物及细胞
2.1.2 实验试剂及耗材
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 主要药品的配制
2.1.5 主要生物学软件
2.1.6 实验相关生物信息学软件
2.2 实验方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 目的片段的亚克隆
2.2.3 真核表达载体的构建
2.2.4 细胞的培养
2.2.5 瞬时转染
2.2.6 双荧光素酶活性的测定
2.2.7 统计分析
2.2.8 细胞中总RNA的提取与反转录cDNA的合成
2.2.9 Real-time PCR的检测
3 结果与分析
3.1 猪FST基因的克隆与测序结果
3.1.1 FST基因编码区的PCR扩增结果
3.1.2 重组克隆质粒PMD18-T-FST的酶切鉴定
3.1.3 民猪FST基因编码区测序结果
3.2 α-actin的基因的克隆与测序结果
3.2.1 α-actin的PCR扩增结果
3.2.2 重组质粒pMD18-T-α-actin的酶切鉴定
3.2.3 α-actin测序结果
3.3 P1重组质粒双酶切鉴定结果
3.3.1 pGL3-basic质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果
3.3.2 P1重组质粒菌液PCR鉴定结果
3.3.3 P1重组质粒酶切鉴定结果
3.4 P2重组质粒双酶切鉴定结果
3.4.1 pEGFP-C1质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果
3.4.2 pEGFP-C1-CMV-α-actin菌液PCR鉴定结果
3.4.3 pEGFP-C1-CMV-α-actin重组质粒酶切鉴定结果
3.4.4 CMV-actin的克隆与测序结果
3.4.5 pGL3-basic质粒与pMD18-T-CMV-α-actin质粒的酶切结果
3.4.6 P2重组质粒菌液PCR鉴定结果
3.4.7 P2重组质粒酶切鉴定结果
3.5 双荧光素酶测定结果
3.5.1 C_2C_(12)细胞、PK15细胞的培养及转染效果
3.5.2 双荧光素酶活性检测结果
3.6 P3重组质粒酶切鉴定结果
3.6.1 pEGFP-C1质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果
3.6.2 pEGFP-C1-α-actin与pMD18-T-FST质粒的酶切结果
3.6.3 P3重组质粒菌液PCR鉴定结果
3.6.4 P3重组质粒酶切鉴定结果
3.7 P4重组质粒酶切鉴定结果
3.7.1 pEGFP-C1质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果
3.7.2 pEGFP-C1-CMV-α-actin与pMD18-T-FST质粒的酶切结果
3.7.3 P4重组质粒菌液PCR鉴定结果
3.7.4 P4重组质粒酶切鉴定结果
3.8 Real-time PCR的检测结果
3.8.1 从细胞中提取RNA的质量鉴定
3.8.2 FST基因及相关基因Real-time PCR的检测结果
4 讨论
4.1 载体构建
4.1.1 P1、P2重组质粒的构建
4.1.2 P3、P4重组质粒的构建
4.2 瞬时转染后细胞状态的观察
4.3 FST与MYOD、MYOG、MSTN、GDF11之间的互作分析
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]Myod1和Myog真核共表达载体构建及鉴定[J]. 高宏飞,梁炳生,双卫兵. 中国组织工程研究. 2013(37)
[2]猪MSTN基因的多态性和生长性状关联分析[J]. 刘晓琴,马喜山,唐中林,周荣,杨述林,敖红,牟玉莲,李奎. 畜牧兽医学报. 2013(07)
[3]锌指核酸酶技术制备肌肉生长抑制素基因敲除的五指山小型猪成纤维细胞[J]. 曹随忠,岳成鹤,李西睿,冯冲,龙川,潘登科. 遗传. 2013(06)
[4]卵泡抑素基因过表达对其通路上相关基因表达的影响[J]. 孙亚蒙,张冬杰,张旭,汪亮,解宇,刘娣. 中国畜牧兽医. 2013(05)
[5]MyoG和c-fos基因多态性及其合并基因型与猪肌纤维性状的关联分析[J]. 郭云雁,程笃学,张龙超,颜华,赵克斌,王立贤,刘文忠,郭慧慧,陈来华. 畜牧兽医学报. 2013(02)
[6]转卵泡抑制素基因对绵羊肌源性细胞中肌肉抑制素基因的调控[J]. 岳群华,袁建龙,郝斐,靳木子,王景园,杨文亮,刘东军,仓明. 中国农业科学. 2013(02)
[7]大黄鱼Follistatin基因克隆及表达分析[J]. 刘小飞,薛良义. 生物学杂志. 2012(06)
[8]肌肉特异性表达猪肌肉生长抑制素前肽载体的构建与验证[J]. 于永生,曹阳,罗晓彤,张树敏. 河北农业大学学报. 2012(06)
[9]绵羊Follistatin基因不同功能区片段的原核表达与纯化[J]. 阿米乃·亚日,冉多良,李文蓉,张宁. 中国草食动物科学. 2012(04)
[10]猪MyoD1基因多态性与肉质性状的相关分析[J]. 赵广珍,贾青,张翠翠,雷娜,冯安学,邢增喜. 河北农业大学学报. 2012(04)
硕士论文
[1]猪肌肉组织骨骼肌特异性基因α-actin启动子的克隆及功能验证[D]. 刘京鸽.华中农业大学 2010
[2]双启动子表达载体的构建以及酯酶B1基因的表达[D]. 张韩杰.山东农业大学 2004
本文编号：3338577
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