鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究和随机转座突变方法的建立

发布时间：2021-08-14 06:03

　　鸡毒支原体（Mycoplasma Gallisepticum,MG）属于支原体目、支原体科、支原体属,是禽类重要病原体之一。鸡毒支原体可感染鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、火鸡、家雀等多种禽类,主要表现为呼吸道症状。鸡群感染鸡毒支原体后除表现咳嗽、流鼻涕、流泪、哕音、呼吸困难等症状外,还可导致蛋鸡产蛋率下降,种蛋孵化率降低,肉鸡生长发育受阻,饲料转化率降低。该病发病率极高,几乎100%的鸡场都有此病,鸡场一旦感染就很难彻底清除,给养禽业带来巨大的损失。并且,鸡毒支原体的感染可使鸡群对其它病原微生物如大肠杆菌、禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等的易感性增加,导致混合或继发感染,引起更为严重的呼吸道综合征,从而使损失加剧。丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase）是丙酮酸脱氢酶复合体的其中的一个酶,是关键的限速酶。已经有研究表明,支原体参与代谢的酶类如烯醇化酶（enolase）,甘油醛-3一磷酸脱氢酶（GAPDH）,丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）,除了自身的催化功能外,还可以作为毒力因子参与致病的作用。目前在鸡毒支原体中的的丙酮酸脱氢酶的功能尚不清楚... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：87 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第—篇 文献综述
    第—章 丙酮酸脱氢酶研究进展
        1.1 丙酮酸脱氢酶的概述
        1.2 丙酮酸脱氢酶的结构
        1.3 丙酮酸脱氢酶复合体的催化机理
        1.4 丙酮酸脱氢酶的功能
        1.5 研究鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的意义
    第二章 支原体基因工程研究工具
        2.1 转座子
        2.2 目的基因的敲除
        2.3 报告基因
        2.4 鸡毒支原体随机插入突变的研究意义
第二篇 丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究
    第三章 丙酮酸脱氢酶E1和E2亚基的原核表达及多抗制备
        1 材料和方法
            1.1 菌种、载体、抗体及动物
            1.2 仪器
            1.3 试剂
            1.4 鸡毒支原体Rlow株基因组的提取
            1.5 pdha和pdhb基因的overlap PCR扩增
            1.6 重组表达载体的构建
            1.7 目的基因的原核表达和蛋白纯化
            1.8 多克隆抗体的制备及免疫原性的分析
        2 结果
            2.1 Overlap PCR扩增目的基因
            2.2 重组表达载体的构建
            2.3 重组蛋白的诱导表达及纯化
            2.4 多抗的鉴定
        3 讨论
    第四章 鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的酶活性研究
        1 材料和方法
            1.1 仪器
            1.2 试剂
            1.3 二氯吲哚酚法测定丙酮酸脱氢酶活性
            1.4 标准曲线测定
            1.5 DCPIP的稳定性
            1.6 His-PDHA和His-PDHB的相对比活性测定
            1.7 不同DCPIP浓度对反应速率的影响
            1.8 pH对His-PDH活性影响
            1.9 温度对His-PDH活性的影响
            1.10 金属离子对His-PDH活性的影响
        2 结果
            2.1 DCPIP标准曲线的制作
            2.2 DCPIP稳定性试验
            2.3 His-PDH的比活力测定
            2.4 米氏常数的测定
            2.5 温度对His-PDH酶活性的影响
            2.6 pH值对His-PDH的影响
            2.7 金属离子对反应的影响
        3 讨论
    第五章 鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1和E2亚基的亚细胞定位及其生物学特性研究
        1 材料与方法
            1.1 菌株、细胞株和载体
            1.2 仪器
            1.3 试剂
            1.4 鸡毒支原体膜蛋白的提取
            1.5 Western-blot试验
            1.6 间接免疫荧光试验
            1.7 纤连蛋白结合试验
            1.8 配体结合试验
            1.9 黏附及其黏附抑制试验
            1.10 膜表面展示载体的构建和表达
            1.11 重组菌对DF-1细胞的黏附和黏附抑制试验
            1.12 多抗血清体外杀菌试验
        2 结果
            2.1 Western-blot检测
            2.2 悬浮法免疫荧光检测
            2.3 纤连蛋白结合试验
            2.4 配体结合试验
            2.5 鸡毒支原体黏附细胞及其黏附抑制试验
            2.6 膜表面展示载体的构建和表达
            2.7 PDHA和PDHB介导的大肠杆菌黏附DF1细胞
            2.8 His-PDHA和His-PDHB多抗血清的体外杀菌实验
        3 讨论
第三篇 随机缺失转座载体的构建
    第六章 鸡毒支原体随机缺失转座载体的构建
        1 材料与方法
            1.1 菌株与载体
            1.2 仪器
            1.3 试剂
            1.4 药敏试验
            1.5 mini-Tn4001SpGm转座子的构建策略
            1.6 mini-Tn4001SpGm载体的构建
            1.7 随机转座载体电转化
            1.8 随机突变株筛选方法
            1.9 突变株的Southern杂交鉴定
            1.10 插入位置的确认
        2 结果
            2.1 药敏试验
            2.2 液体药敏试验
            2.3 随机缺失转座载体的构建
            2.4 随机缺失转座载体的构建
            2.5 重组子筛选鉴定结果
        4 讨论
参考文献
全文总结
致谢
攻读硕士期间论文发表情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]丙酮酸脱氢酶E1α亚单位缺陷导致Leigh综合征[J]. 张尧,孙芳,杨艳玲,常杏芝,戚豫,齐朝月,肖江喜,秦炯,吴希如.  中国当代儿科杂志. 2007(03)



本文编号：3341915