牛疱疹病毒5型编码的miR-10对其靶基因Us3的调控作用
发布时间：2021-08-14 05:54
牛疱疹病毒5型（Bovine herpesvirus5, BoHV-5）属于α疱疹病毒亚科,具有嗜神经性和潜伏感染的特征。BoHV-5能进入中枢神经系统（CNS）,引起犊牛的致死性脑膜脑炎,给养牛业造成很大的损失。本实验室曾经报道在BoHV-5中存在11个IniRNA的编码基因,能够编码16条成熟的miRNA.这些niRNA能够在上皮细胞中大量表达,其中miR-10是表达量最大的,该IniRNA的前体pre-miR-10的5p端和3p端都能产生一个成熟的miRNA,但其生物学功能还不是很清楚.本实验通过生物信息学预测找出了可能受到miR-10调控的靶基因,然后通过双荧光素酶报告系统筛选出能够与miR-10相互作用的靶基因。然后再在转录水平和翻译水平进一步验证（?）iR-10-5p对其靶基因的调控作用。主要工作包括：1.miR-10靶基因的预测及验证首先经过生物信息学预测软件（miRanda）分析,得到多个潜在受到miR-10调控的靶基因,经分析比较挑出UL23、BICP22、UL28、UL37、UL39和Us3。继而用PCR克隆上上述基因的3’UTR,连接到报告质粒psiCHECK-2...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
引言
1.1 BoHV5流行病学及其致病性
1.2 BoHV-5的分子生物学特征
1.3 miRNA的生物合成及作用机制
1.4 病毒的miRNA
1.4.1 疱疹病毒与miRNA
1.5 BoHV-1和BoHV-5编码的miRNA
1.6 本研究的目的和意义
第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒、菌种、质粒与细胞
2.1.2 实验仪器及耗材
2.1.3 酶及主要事试剂
2.1.4 主要溶液及培养基的配制
2.1.5 本研究中所用的寡核苷酸
2.1.6 实验动物
2.2 试验方法
2.2.1 双荧光素酶报告质粒的构建
2.2.2 双荧光报告系统检测
2.2.3 Real-time检测在RNA水平的调节
2.2.4 Us3多抗的制备
2.2.5 对Us3蛋白表达情况的检测
2.2.6 一步法生长曲线的测定
2.2.7 凋亡蛋白的检测
2.2.8 流式细胞实验
2.2.9 统计学方法
第3章 结果和分析
3.1 BoHV-5 miR-10靶基因的预测
3.2 BoHV5 miR-10与靶基因相互作用的验证
3.2.1 靶基因3UTR区的克隆
3.2.2 双荧光素报告质粒的构建
3.2.3 双荧光素酶报告系统验证miR-10对预测靶基因的调控
3.2.4 miR-10-5p种子序列突变后对靶基因的调控
3.2.5. miR-10-5p对靶基因的调控的剂量依赖
3.3 miR-10-5p对靶基因Us3的调控在转录水平上的影响
3.4 miR-10-5p对靶基因Us3的调控在翻译水平上的影响
3.4.1 BoHV-5 Us3的原核表达
3.4.2. 对融合蛋白的鉴定
3.4.3 对Us3蛋白表达情况的检测
3.5 过量表达miR-10-5p对病毒在上皮细胞中增殖的影响
3.6 过量表达miR-10-5p后病毒对上皮细胞凋亡的影响
3.6.1 对凋亡蛋白检测
3.6.2 流式细胞仪检测上皮细胞凋亡
3.7 过量表达miR-10-5p对病毒诱导神经细胞凋亡的影响
3.7.1 对凋亡蛋白检测
3.7.2 流式细胞仪检测神经细胞凋亡
第4章 讨论与结论
4.1 BoHV5 mi-10潜在靶基因的预测及筛选
4.2 miR-10对预测靶基因调控验证及对靶基因Us3的调控
4.3 过量表达miR-10-5p对病毒在上皮细胞增殖的影响
4.4 过量表达miR-10-5p后病毒对上皮细胞凋亡的影响
4.5 过量表达miR-10-5p病毒对上皮细胞凋亡的影响神经细胞凋亡的影响
4.6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3341899
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
引言
1.1 BoHV5流行病学及其致病性
1.2 BoHV-5的分子生物学特征
1.3 miRNA的生物合成及作用机制
1.4 病毒的miRNA
1.4.1 疱疹病毒与miRNA
1.5 BoHV-1和BoHV-5编码的miRNA
1.6 本研究的目的和意义
第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒、菌种、质粒与细胞
2.1.2 实验仪器及耗材
2.1.3 酶及主要事试剂
2.1.4 主要溶液及培养基的配制
2.1.5 本研究中所用的寡核苷酸
2.1.6 实验动物
2.2 试验方法
2.2.1 双荧光素酶报告质粒的构建
2.2.2 双荧光报告系统检测
2.2.3 Real-time检测在RNA水平的调节
2.2.4 Us3多抗的制备
2.2.5 对Us3蛋白表达情况的检测
2.2.6 一步法生长曲线的测定
2.2.7 凋亡蛋白的检测
2.2.8 流式细胞实验
2.2.9 统计学方法
第3章 结果和分析
3.1 BoHV-5 miR-10靶基因的预测
3.2 BoHV5 miR-10与靶基因相互作用的验证
3.2.1 靶基因3UTR区的克隆
3.2.2 双荧光素报告质粒的构建
3.2.3 双荧光素酶报告系统验证miR-10对预测靶基因的调控
3.2.4 miR-10-5p种子序列突变后对靶基因的调控
3.2.5. miR-10-5p对靶基因的调控的剂量依赖
3.3 miR-10-5p对靶基因Us3的调控在转录水平上的影响
3.4 miR-10-5p对靶基因Us3的调控在翻译水平上的影响
3.4.1 BoHV-5 Us3的原核表达
3.4.2. 对融合蛋白的鉴定
3.4.3 对Us3蛋白表达情况的检测
3.5 过量表达miR-10-5p对病毒在上皮细胞中增殖的影响
3.6 过量表达miR-10-5p后病毒对上皮细胞凋亡的影响
3.6.1 对凋亡蛋白检测
3.6.2 流式细胞仪检测上皮细胞凋亡
3.7 过量表达miR-10-5p对病毒诱导神经细胞凋亡的影响
3.7.1 对凋亡蛋白检测
3.7.2 流式细胞仪检测神经细胞凋亡
第4章 讨论与结论
4.1 BoHV5 mi-10潜在靶基因的预测及筛选
4.2 miR-10对预测靶基因调控验证及对靶基因Us3的调控
4.3 过量表达miR-10-5p对病毒在上皮细胞增殖的影响
4.4 过量表达miR-10-5p后病毒对上皮细胞凋亡的影响
4.5 过量表达miR-10-5p病毒对上皮细胞凋亡的影响神经细胞凋亡的影响
4.6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3341899
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3341899.html
