人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

发布时间：2021-08-15 05:58

　　【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子（LYZop）分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞（BMEC）、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT... 

【文章来源】：中国农业科学. 2020,53(18)北大核心CSCD

【文章页数】：13 页

【部分图文】：

牛乳蛋白及人溶菌酶基因密码子使用RSCU值聚类分析

CodonW比较优化前后序列，结果表明，LYZcw、LYZop22、LYZop第三位碱基即GC3s含量分别为0.407、0.450、0.757。m RNA二级结构最小自由能MFE从-138.83 kcal/mol(LYZcw）分别降低到了-141.02kcal/mol(LYZop22）和-178.12 kcal/mol(LYZop),m RNA二级结构稳定性明显提高。对m RNA翻译起始区100个碱基进行二级结构分析，发现相比于LYZcw(-29.7 kcal/mol),LYZop22(-26.4 kcal/mol）和LYZop(-31.0 kcal/mol）密码子优化并没有明显改变翻译起始区二级结构最小自由能，相反在5′端引入了更多的茎环结构（图3），有利于核糖体与m RNA的结合并启动翻译。2.5 人溶菌酶-荧光素融合载体构建及溶菌酶表达分析

电泳和测序结果表明，成功克隆到了人溶菌酶野生型LYZcw、翻译起始区密码子优化的LYZop22 CDS区序列及全基因合成的全局密码子优化的LYZop CDS区序列，且与预期序列信息一致（图4）。Nco1酶切和测序结果表明，成功构建了pGL3-LYZcw/op22/op 3个人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体，且LYZcw、LYZop22、LYZop编码区与萤火虫荧光素酶基因正确融合，没有移码突变（图5）。图5 pGL3-LYZcw/op22/op载体Nco1酶切鉴定

【参考文献】：
期刊论文
[1]体细胞核移植技术生产转人溶菌酶基因（hLYZ）牛胚胎的研究[J]. 熊显荣,李文哲,王丽君,王勇胜,苏建民,华松,张涌.  农业生物技术学报. 2011(02)
[2]溶菌酶对猪肉的保鲜作用[J]. 李永富,孙震,史锋,张颖,马金生,蒋立凤.  上海农业学报. 2009(04)
[3]溶菌酶对仔猪腹泻的预防作用[J]. 朱军英,崔立,沈彦萍,施彬.  中国畜牧杂志. 2009(03)



本文编号：3343991