猪附红细胞体OxaA基因膜外区蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

发布时间：2021-08-15 05:08

　　猪附红细胞体（Eperythrozoon suis）可以引起猪附红细胞体病,它主要存在于猪的红细胞表面、血浆以及骨髓内,引起主要症状有黄疸、发热和贫血。对于猪附红细胞体病暂时没有较好的手段控制,而且已知的功能性基因偏少。因此,本试验根据NCBI中公布的猪附红细胞体基因组序列,PCR扩增获得包括全基因在内1561bp的吉林株膜蛋白OxaA基因序列,并上传NCBI（登录号：YP₀04249851.1）。获得的OxaA基因序列与猪附红细胞体基因组KI₃806（登录号：NC₀15153）比较,存在21处同义突变,核苷酸序列同源性为98%,氨基酸序列同源性为100%。利用ExPASy、CPHmodels数据库及TMHMM等方法对OxaA蛋白的结构和理化性质进行了分析。结果显示,OxaA蛋白的理论等电点为9.98,偏碱性；存在多个信号肽可能位点和5个跨膜区域；二级结构以α螺旋、不规则卷曲为主；三级结构有明显的折叠层次； B细胞抗原表位可能存在于20～24位、28～40位、45～53位、142～150位、260～263位氨基酸处；在9... 

【文章来源】：延边大学吉林省 211工程院校

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
目录
前言
    1. 研究概况
    2 猪附红细胞体病的发病和流行特点及其防治方法
    3 猪附红细胞体病诊断方法的研究进展
        3.1 形态学观察
        3.2 酶联免疫吸附试验
        3.3 聚合酶链式反应
        3.4 单克隆抗体技术
        3.5 环介导等温扩增技术
    4 猪附红细胞体基因及蛋白研究进展
    5 本研究的目的及意义
材料与方法
    1 材料
        1.1 试验样本
        1.2 常用载体和感受态菌
        1.3 实验所需酶和试剂
        1.4 主要仪器设备
        1.5 试验所用部分试剂
    2 方法
        2.1 引物的设计
        2.2 血液基因组DNA的提取
        2.3 OxaA蛋白生物信息学
        2.4 吉林株OxaA基因的PCR扩增
        2.5 吉林株OxaA基因的纯化回收
        2.6 感受态细胞的制备
        2.7 猪附红细胞体OxaA基因的克隆与鉴定
        2.8 OxaA基因膜外区片段的PCR扩增
        2.9 膜外区片段A和B的纯化与回收
        2.10 猪附红细胞体OxaA基因膜外区片段的克隆与鉴定
        2.11 猪附红细胞体OxaA基因膜外区片段的亚克隆与鉴定
        2.12 表达菌株的诱导表达
        2.13 诱导产物的SDS聚丙烯酰胺电泳
        2.14 表达产物的Western blotting分析
        2.15 重组蛋白的纯化
        2.16 建立重组蛋白的间接ELISA方法
结果
    1 吉林株OxaA基因的PCR扩增
    2. 猪附红细胞体OxaA基因的克隆与鉴定
    3 吉林株猪附红细胞体OxaA基因的生物信息分析
    4 OxaA基因膜外区片段的PCR扩增
    5 膜外区片段重组克隆质粒的PCR及酶切鉴定
    6 膜外区片段膜外区片段重组表达质粒的PCR及酶切鉴定
    7 表达菌株的诱导表达
    8 表达产物的免疫印迹分析
    9 重组A蛋白与重组B蛋白的可溶性分析
    10 重组A蛋白与重组B蛋白的纯化
    11 间接ELISA检测方法的建立
        11.1 纯化抗原最佳包被浓度的筛选与血清最佳稀释度的筛选
        11.2 最适封闭液的筛选和最佳封闭时间的筛选
        11.3 血清最佳作用时间的筛选
        11.4 酶标二抗最佳作用时间和最佳稀释度的筛选
        11.5 底物最适显色时间的筛选
        11.6 阳性和阴性临界值的确定
        11.7 特异性试验结果
        11.8 重复性试验结果
        11.9 临床样本检测结果
讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪附红细胞体SRP54基因的克隆及表达质粒的构建[J]. 邢莹,贾立军,张守发.  动物医学进展. 2011(12)
[2]猪附红细胞体50S核糖体基因PCR检测方法的建立及应用[J]. 刘明明,贾立军,薛书江,梁晚枫,张守发.  动物医学进展. 2011(12)
[3]猪附红细胞体培养方法及药敏试验研究[J]. 姜富成,刘聚祥,王克宁,李辉,刘静,王建平.  动物医学进展. 2011(07)
[4]新基因功能的研究策略[J]. 字友梅,王少元.  医学综述. 2011(10)
[5]猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法的建立及应用[J]. 郑秀红,贾立军,邢莹,张守发.  中国兽医学报. 2011(02)
[6]附红细胞体研究进展[J]. 卢新荣,张守峰,钟发刚.  新疆农垦科技. 2011(01)
[7]猪附红细胞体巢式PCR诊断方法的建立及初步应用[J]. 郑秀红,邢莹,贾立军,薛书江,甄立家,张守发.  中国畜牧兽医. 2011(01)
[8]猪附红细胞体病原特征及其致病性分析[J]. 王广秀,徐镔蕊,李伟,杜艳.  中国兽医学报. 2010(09)
[9]猪附红细胞体病诊断与防控[J]. 拜廷阳,赵德明,吴志明,闫若潜,普志平.  动物医学进展. 2010(08)
[10]用特殊染色法对猪附红细胞体病的诊断研究[J]. 黄小东,潘耀谦,方满新.  动物医学进展. 2010(05)

博士论文
[1]曲霉CJ22-326产壳聚糖酶基因的克隆、表达与定点突变[D]. 李松林.江南大学 2009
[2]具有潜在疫苗价值的弓形虫新基因wx2，wx的筛选与鉴定[D]. 吴翔.中南大学 2007

硕士论文
[1]林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因原核表达及免疫原性的初步分析[D]. 白雪梅.延边大学 2011
[2]猪附红细胞体亚单位疫苗的初步研究[D]. 吕舟.延边大学 2009
[3]禽呼肠孤病毒非结构蛋白的克隆表达及重组蛋白ELISA方法的建立[D]. 秦春香.广西大学 2007



本文编号：3343915