抗致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌OmpA单克隆抗体的制备及ompA基因缺失株特性的初步研究

发布时间：2021-08-15 16:20

　　鹅卵黄性腹膜炎,是主要发生于产蛋种鹅的一种急性传染病,产蛋母鹅会因为该病的发生出现生产性能下降、绝产甚至死亡,从而对养殖业造成巨大经济损失。外膜蛋白A是广泛存在于革兰氏阴性肠杆菌外膜上的蛋白,N端具有21个氨基酸的信号肽序列。OmpA又称为热修饰蛋白,是细菌的抗宿主杀伤因子,同时作为微孔蛋白能够维持细菌外膜结构的完整以及细菌的正常形态,同时也是细菌重要的毒力因子,在细菌的粘附和侵袭的起始过程中都起着关键作用。目前对于该病的防治主要是依赖于抗生素,但是随着集约化养殖业的发展以及抗生素治疗的广泛应用,细菌的耐药性也随之增加,多种抗生素的共同使用造成的抗生素残留同时也危害着人类的健康。1.致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A的克隆表达以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌分离株G8107菌株基因组DNA为模板,用PCR法扩增ompA基因,PCR产物用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切产物回收与相同黏性末端的表达载体pET-32a（+）连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主菌BL21（DE3）,抽提质粒,酶切鉴定及测序正确后诱导表达。对转化菌株以IPTG进行诱导后,裂解细菌,离心,上清进行... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
文献综述
    1. 鹅卵黄性腹膜炎
        1.1 病原学
        1.2 流行病学
        1.3 诊断和防治
    2. 致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌OmpA
        2.1 OmpA的基本结构和功能
        2.2 OmpA的研究进展
    3. Red/ET同源重组技术
        3.1 Red/ET重组系统的作用机制
        3.2 Red/ET重组系统相关质粒
        3.3 Red/ET重组技术的应用展望
    参考文献
研究一 致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A的克隆表达
    摘要
    1 材料与方法
        1.1 菌种与载体
        1.2 试剂与培养基
        1.3 引物设计及合成
        1.4 PCR扩增目的基因
        1.5 目的基因ompA的克隆及测序
        1.6 OmpA融合蛋白的表达及最佳表达条件摸索
        1.7 His-OmpA蛋白的纯化
    2. 结果与分析
        2.1 ompA片段的PCR扩增结果
        2.2 目的片段和表达载体的酶切结果
        2.3 重组质粒pET-32a-ompA的酶切鉴定
        2.4 OmpA重组质粒表达条件摸索结果
        2.5 His-OmpA蛋白纯化后的SDS-PAGE
    3. 讨论
研究二 抗致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A单克隆抗体的制备
    摘要
    1 材料与方法
        1.1 免疫原、细胞及实验动物
        1.2 试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 动物免疫
        1.5 筛选最适包被抗原量确定
        1.6 细胞融合
        1.7 阳性杂交瘤细胞的筛选
        1.8 单克隆抗体的亚类鉴定
        1.9 腹水的制备及单抗效价的测定
        1.10 单克隆抗体特异性的鉴定
        1.11 Western-blot验证OmpA在细菌中的分布情况
    2. 结果与分析
        2.1 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
        2.2 单克隆抗体特异性的鉴定结果
        2.3 抗OmpA单克隆抗体的亚类鉴定结果
        2.4 抗OmpA单克隆抗体的效价测定及腹水的特异性鉴定
        2.5 Western-blot验证OmpA在细菌中的分布情况
    3. 讨论
研究三 致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A基因缺失株的构建及其相关功能分析
    摘要
    1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒及培养基
        1.2 主要仪器和引物
        1.3 引物设计
        1.4 50bp同源臂FRT卡那霉素抗性片段的扩增及回收
        1.5 pRedET质粒及含同源臂抗性片段的电转化
        1.6 AompA菌的鉴定
        1.7 ΔompA G8107大肠杆菌与G8107大肠杆菌生物学特性对比
        1.8 动物实验
    2. 结果与分析
        2.1 含50bp同源臂FRT卡那霉素抗性片段PCR扩增
        2.2 ompA基因缺失G8107大肠杆菌菌株的鉴定
        2.3 ΔompA G8107大肠杆菌生物学特性鉴定
        2.4 动物实验
    3. 讨论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的克隆与表达[J]. 余波,徐景峨,王璇,谭诗文.  中国畜牧兽医. 2012(12)
[2]大肠杆菌外膜蛋白A研究进展[J]. 宋舟,陈伟,张立艳,董海兵,白换力,付本懂,申海清,韦旭斌.  中国畜牧兽医. 2012(05)
[3]单克隆抗体研究进展[J]. 刘萍,陈苗苗,刘学荣,牟克斌,黄银君.  中国畜牧兽医. 2012(01)
[4]大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达[J]. 呼锐,佟春玉,崔玉东.  黑龙江八一农垦大学学报. 2011(01)
[5]种鹅“蛋子瘟”的诊断与防治[J]. 李春江,张培文,单既智,王春华.  水禽世界. 2009(06)
[6]母鹅卵黄性腹膜炎的发生及防治[J]. 吴立芬.  现代农业科技. 2009(13)
[7]Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展[J]. 张雪,温廷益.  中国生物工程杂志. 2008(12)
[8]生物技术和药物研究进展[J]. 刘兢.  中国科学技术大学学报. 2008(08)
[9]鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的克隆与表达[J]. 周祖涛,陈芬芬,李自力,胡思顺,孙淑娜,吴仁蔚,肖运才,许青荣,毕丁仁.  中国兽医学报. 2008(01)
[10]鹅大肠杆菌性腹膜炎的发生及其综合防制[J]. 敖礼林,曾秋生,陈彬,余定达.  农村实用科技信息. 2006(03)

硕士论文
[1]致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌相关特异蛋白的鉴定及其单克隆抗体的研制[D]. 张勇攀.扬州大学 2012
[2]致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp双基因缺失突变株的构建及其相关功能性分析[D]. 王锴.扬州大学 2010



本文编号：3344883