新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
发布时间：2021-08-18 03:30
为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒（novel duck reovirus,NDRV）的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。
【文章来源】：浙江农业学报. 2020,32(04)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
NDRV一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR扩增曲线(A)和标准曲线(B)
采用建立的一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法对临床采集的239份疑似病例样品(肝脏、脾脏)进行检测,并与常规RT-PCR方法进行比较。结果显示,常规RT-PCR检测239份样品时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。图3 NDRV一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR特异性试验
图2 NDRV一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR敏感性试验表1 一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR组内和组间重复性试验Table 1 Intra assay and inter assay reproducibility of one-step real-time TaqMan-MGB RT-PCR RNA标准品浓度Concentration of standard (copies·μL-1) 组内变异实验 Inter-assay variability 组间变异实验 Intra-assay variability 平均数 Mean±SD 变异系数 CV/% 平均数 Mean±SD 变异系数 CV/% 1×108 14.89±0.066 0.44 14.99±0.127 0.85 1×107 17.98±0.146 0.81 17.92±0.265 1.48 1×106 21.84±0.163 0.75 21.81±0.198 0.91 1×105 24.93±0.181 0.73 24.81±0.272 1.10 1×104 28.32±0.187 0.66 27.98±0.447 1.60
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭呼肠孤病毒基因Ⅰ型与Ⅱ型鉴别诊断RT-PCR方法的建立与应用[J]. 云涛,张存,华炯钢,余斌,叶伟成,陈柳,倪征. 农业生物技术学报. 2016(12)
[2]一种新型鸭呼肠孤病毒SYBR GreenⅡ荧光定量PCR方法的建立[J]. 丁明洋,戚伟强,陈宗艳,朱杰,吴巧梅,缪秋红,李传峰,吴润,刘光清. 中国动物传染病学报. 2016(01)
[3]新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 袁远华,吴志新,王俊峰,黄兴国,贺东生,黄淑坚. 中国预防兽医学报. 2013(09)
[4]新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 陈少莺,陈仕龙,林锋强,王劭,江斌,程晓霞,朱小丽,李兆龙. 病毒学报. 2012(03)
[5]一种番鸭“新肝病”在浙江的流行特点分析[J]. 陆新浩,刘鸿,陈秋英,任祖伊,黄建勇,吴勇. 中国家禽. 2011(15)
[6]3种禽类呼肠孤病毒血清学相关性及致细胞病变差异分析[J]. 陈仕龙,陈少莺,程晓霞,江斌,林锋强,王劭,朱小丽,李兆龙,张世忠. 畜牧兽医学报. 2011(04)
[7]新致病型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定[J]. 黄瑜,傅光华,施少华,万春和,程龙飞,江斌,陈红梅,林芳,林建生,张大丙. 中国兽医杂志. 2009(12)
[8]一株鹅源呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 王光锋,王永坤,王建业,朱国强,严维巍,周继宏,庄国宏,钱钟. 中国家禽. 2003(15)
[9]番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 吴宝成,陈家祥,姚金水,陈枝华,陈文列,李国平,曾显成. 福建农业大学学报. 2001(02)
本文编号：3349100
【文章来源】：浙江农业学报. 2020,32(04)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
NDRV一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR扩增曲线(A)和标准曲线(B)
采用建立的一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法对临床采集的239份疑似病例样品(肝脏、脾脏)进行检测,并与常规RT-PCR方法进行比较。结果显示,常规RT-PCR检测239份样品时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。图3 NDRV一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR特异性试验
图2 NDRV一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR敏感性试验表1 一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR组内和组间重复性试验Table 1 Intra assay and inter assay reproducibility of one-step real-time TaqMan-MGB RT-PCR RNA标准品浓度Concentration of standard (copies·μL-1) 组内变异实验 Inter-assay variability 组间变异实验 Intra-assay variability 平均数 Mean±SD 变异系数 CV/% 平均数 Mean±SD 变异系数 CV/% 1×108 14.89±0.066 0.44 14.99±0.127 0.85 1×107 17.98±0.146 0.81 17.92±0.265 1.48 1×106 21.84±0.163 0.75 21.81±0.198 0.91 1×105 24.93±0.181 0.73 24.81±0.272 1.10 1×104 28.32±0.187 0.66 27.98±0.447 1.60
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭呼肠孤病毒基因Ⅰ型与Ⅱ型鉴别诊断RT-PCR方法的建立与应用[J]. 云涛,张存,华炯钢,余斌,叶伟成,陈柳,倪征. 农业生物技术学报. 2016(12)
[2]一种新型鸭呼肠孤病毒SYBR GreenⅡ荧光定量PCR方法的建立[J]. 丁明洋,戚伟强,陈宗艳,朱杰,吴巧梅,缪秋红,李传峰,吴润,刘光清. 中国动物传染病学报. 2016(01)
[3]新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 袁远华,吴志新,王俊峰,黄兴国,贺东生,黄淑坚. 中国预防兽医学报. 2013(09)
[4]新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 陈少莺,陈仕龙,林锋强,王劭,江斌,程晓霞,朱小丽,李兆龙. 病毒学报. 2012(03)
[5]一种番鸭“新肝病”在浙江的流行特点分析[J]. 陆新浩,刘鸿,陈秋英,任祖伊,黄建勇,吴勇. 中国家禽. 2011(15)
[6]3种禽类呼肠孤病毒血清学相关性及致细胞病变差异分析[J]. 陈仕龙,陈少莺,程晓霞,江斌,林锋强,王劭,朱小丽,李兆龙,张世忠. 畜牧兽医学报. 2011(04)
[7]新致病型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定[J]. 黄瑜,傅光华,施少华,万春和,程龙飞,江斌,陈红梅,林芳,林建生,张大丙. 中国兽医杂志. 2009(12)
[8]一株鹅源呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 王光锋,王永坤,王建业,朱国强,严维巍,周继宏,庄国宏,钱钟. 中国家禽. 2003(15)
[9]番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 吴宝成,陈家祥,姚金水,陈枝华,陈文列,李国平,曾显成. 福建农业大学学报. 2001(02)
本文编号：3349100
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