基于猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白及抗原表位的间接ELISA检测方法的建立
发布时间：2021-08-21 20:03
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的病毒性传染病。该病以妊娠母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍,新生及断奶前仔猪高死亡率以及各年龄段尤其是仔猪的呼吸道疾病为特征。1987年该病第一次在美国被发现,1991年在荷兰分离到该病毒,1996年中国成功分离到了第一株PRRSV CH-1a株。目前该病流行于世界各养猪国家,给世界养猪业造成了巨大的经济损失,是威胁当前养猪业最重要的传染病之一。目前检测PRRSV抗体的方法有很多,在临床上主要是用ELISA的方法检测,其中以N蛋白和GP5蛋白包被居多,在临床上都有较高的符合率。本研究主要以纯化的重组N蛋白和人工合成的两个N蛋白抗原（P30和P32）表位做包被抗原,建立方法进行临床样本检测,并和商品化试剂盒（IDEXX和LSI）进行比较。主要研究内容如下：1.PRRSVORF7基因的克隆与表达...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1. 文献综述
1.1 PRRSV的分子生物学特征
1.1.1 PRRSV基因组结构
1.1.2 PRRSV非结构蛋白的功能
1.1.3 PRRSV结构蛋白的功能
1.2 PRRSV体液免疫和细胞免疫的研究进展
1.2.1 PRRSV体液免疫研究进展
1.2.2 PRRSV细胞免疫研究进展
1.3 PRRSV疫苗研究进展
1.3.1 弱毒活疫苗
1.3.2 灭活疫苗
1.3.3 基因工程疫苗
1.4 PRRSV诊断方法的研究进展
1.4.1 临床症状与病理变化
1.4.2 病毒分离与分子生物学诊断方法
1.4.3 血清学诊断
1.5 本研究的目的与意义
2. 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 毒株,菌株,实验动物和多肽
2.1.2 载体与试剂
2.1.3 引物的设计与合成
2.1.4 抗体
2.1.5 血清
2.1.6 SDS-PAGE和Western blot试剂和溶液
2.1.7 培养基的配制
2.1.8 间接ELISA所需试剂的配制
2.1.9 主要仪器
2.1.10 其他试剂耗材
2.2 方法
2.2.1 PRRSV病毒的培养
2.2.2 PRRSV的RNA提取
2.2.3 PRRSV ORF7基因的PCR扩增与检测
2.2.4 PCR产物的回收和纯化
2.2.5 纯化产物和T载体连接
2.2.6 连接产物转化到DH5α
2.2.7 重组质粒的提取
2.2.8 ORF7基因片段的序列测定及分析
2.2.9 原核表达载体pET32a-ORF7的构建
2.2.10 重组表达质粒转化到大肠杆菌BL_(21)(DE3)感受态
2.2.11 重组表达质粒pET32a-ORF7在大肠杆菌BE_(21)(DE3)中的诱导表达
2.2.12 表达产物的SDS-PAGE分析
2.2.13 表达产物的纯化
2.2.14 表达产物的Western blot检测
2.2.15 PRRSV N蛋白两个抗原表位的合成肽的分析与合成
2.2.16 间接ELISA方法的操作程序
2.2.17 重组N蛋白,P30,P32间接ELISA方法最佳反应条件的确定
3. 结果与分析
3.1 ORF7基因PCR扩增结果
3.2 原核表达载体pET32a-ORF7鉴定
3.3 原核表达载体pET32a-ORF7在大肠杆菌中的诱导表达
3.4 表达产物的纯化
3.5 纯化蛋白的浓度的测定
3.6 表达产物的Western blot鉴定
3.7 N蛋白抗原表位的合成肽P30和P32的选取
3.8 间接ELISA方法最佳反应条件的确定
3.8.1 合成肽最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
3.8.2 最佳二抗稀释倍数的确定
3.8.3 判定标准的确定
3.8.4 特异性试验结果
3.8.5 敏感性试验
3.8.6 重复性试验结果
3.8.7 临床样品检测
4. 讨论
4.1 PRRSV ORF7基因的选择
4.2 N蛋白两个抗原表位的选择
4.3 关于间接ELISA方法的建立
4.4 建立的ELISA方法和商品化试剂盒的比较
5. 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖和呼吸综合征病毒HuN4株nsp9、nsp10、nsp11对毒力影响的研究[J]. 姜一峰,周艳君,王亚欣,朱建平,虞凌雪,徐彦召,童武,童光志. 中国动物传染病学报. 2011(06)
[2]异源5′非翻译区在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性拯救过程中的功能解析[J]. 高飞,陆嘉琦,姚火春,杨倩,袁世山,童光志. 中国动物传染病学报. 2011(06)
[3]猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4细胞核定位研究[J]. 刘惠莉,方莹. 南京农业大学学报. 2011(04)
[4]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CD4+ T细胞表位优势区的鉴定[J]. 方剑玉,郑其升,郭小参,侯凤香,王琳,陶红梅,侯继波,陈溥言. 南京农业大学学报. 2011(01)
[5]猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗研究进展[J]. 吴佳俊,遇秀玲,蒋桃珍,田克恭. 中国预防兽医学报. 2010(08)
[6]用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用[J]. 刘长龙,李燕华,袁世山. 安徽农业科学. 2010(23)
[7]多重RT-PCR区分PRRSV变异株和经典株方法的建立[J]. 张志成,范红结,陈钟鸣,戴鼎震,何小明. 金陵科技学院学报. 2010(02)
[8]猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究概况[J]. 朱燕秋. 畜牧兽医科技信息. 2010(01)
[9]猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展[J]. 李国娟,田永强,李建强,李宝玉,柳纪省. 生物技术通报. 2009(12)
[10]猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10基因的克隆及序列分析[J]. 周思旋,周碧君,隆华,朱时杰,文明,王开功. 黑龙江畜牧兽医. 2009(19)
本文编号：3356251
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1. 文献综述
1.1 PRRSV的分子生物学特征
1.1.1 PRRSV基因组结构
1.1.2 PRRSV非结构蛋白的功能
1.1.3 PRRSV结构蛋白的功能
1.2 PRRSV体液免疫和细胞免疫的研究进展
1.2.1 PRRSV体液免疫研究进展
1.2.2 PRRSV细胞免疫研究进展
1.3 PRRSV疫苗研究进展
1.3.1 弱毒活疫苗
1.3.2 灭活疫苗
1.3.3 基因工程疫苗
1.4 PRRSV诊断方法的研究进展
1.4.1 临床症状与病理变化
1.4.2 病毒分离与分子生物学诊断方法
1.4.3 血清学诊断
1.5 本研究的目的与意义
2. 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 毒株,菌株,实验动物和多肽
2.1.2 载体与试剂
2.1.3 引物的设计与合成
2.1.4 抗体
2.1.5 血清
2.1.6 SDS-PAGE和Western blot试剂和溶液
2.1.7 培养基的配制
2.1.8 间接ELISA所需试剂的配制
2.1.9 主要仪器
2.1.10 其他试剂耗材
2.2 方法
2.2.1 PRRSV病毒的培养
2.2.2 PRRSV的RNA提取
2.2.3 PRRSV ORF7基因的PCR扩增与检测
2.2.4 PCR产物的回收和纯化
2.2.5 纯化产物和T载体连接
2.2.6 连接产物转化到DH5α
2.2.7 重组质粒的提取
2.2.8 ORF7基因片段的序列测定及分析
2.2.9 原核表达载体pET32a-ORF7的构建
2.2.10 重组表达质粒转化到大肠杆菌BL_(21)(DE3)感受态
2.2.11 重组表达质粒pET32a-ORF7在大肠杆菌BE_(21)(DE3)中的诱导表达
2.2.12 表达产物的SDS-PAGE分析
2.2.13 表达产物的纯化
2.2.14 表达产物的Western blot检测
2.2.15 PRRSV N蛋白两个抗原表位的合成肽的分析与合成
2.2.16 间接ELISA方法的操作程序
2.2.17 重组N蛋白,P30,P32间接ELISA方法最佳反应条件的确定
3. 结果与分析
3.1 ORF7基因PCR扩增结果
3.2 原核表达载体pET32a-ORF7鉴定
3.3 原核表达载体pET32a-ORF7在大肠杆菌中的诱导表达
3.4 表达产物的纯化
3.5 纯化蛋白的浓度的测定
3.6 表达产物的Western blot鉴定
3.7 N蛋白抗原表位的合成肽P30和P32的选取
3.8 间接ELISA方法最佳反应条件的确定
3.8.1 合成肽最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
3.8.2 最佳二抗稀释倍数的确定
3.8.3 判定标准的确定
3.8.4 特异性试验结果
3.8.5 敏感性试验
3.8.6 重复性试验结果
3.8.7 临床样品检测
4. 讨论
4.1 PRRSV ORF7基因的选择
4.2 N蛋白两个抗原表位的选择
4.3 关于间接ELISA方法的建立
4.4 建立的ELISA方法和商品化试剂盒的比较
5. 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖和呼吸综合征病毒HuN4株nsp9、nsp10、nsp11对毒力影响的研究[J]. 姜一峰,周艳君,王亚欣,朱建平,虞凌雪,徐彦召,童武,童光志. 中国动物传染病学报. 2011(06)
[2]异源5′非翻译区在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性拯救过程中的功能解析[J]. 高飞,陆嘉琦,姚火春,杨倩,袁世山,童光志. 中国动物传染病学报. 2011(06)
[3]猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4细胞核定位研究[J]. 刘惠莉,方莹. 南京农业大学学报. 2011(04)
[4]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CD4+ T细胞表位优势区的鉴定[J]. 方剑玉,郑其升,郭小参,侯凤香,王琳,陶红梅,侯继波,陈溥言. 南京农业大学学报. 2011(01)
[5]猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗研究进展[J]. 吴佳俊,遇秀玲,蒋桃珍,田克恭. 中国预防兽医学报. 2010(08)
[6]用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用[J]. 刘长龙,李燕华,袁世山. 安徽农业科学. 2010(23)
[7]多重RT-PCR区分PRRSV变异株和经典株方法的建立[J]. 张志成,范红结,陈钟鸣,戴鼎震,何小明. 金陵科技学院学报. 2010(02)
[8]猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究概况[J]. 朱燕秋. 畜牧兽医科技信息. 2010(01)
[9]猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展[J]. 李国娟,田永强,李建强,李宝玉,柳纪省. 生物技术通报. 2009(12)
[10]猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10基因的克隆及序列分析[J]. 周思旋,周碧君,隆华,朱时杰,文明,王开功. 黑龙江畜牧兽医. 2009(19)
本文编号：3356251
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