牛轮状病毒VP4基因RT-qPCR检测方法的建立
发布时间：2021-08-21 20:33
旨在建立快速特异的牛轮状病毒（BRV）实时荧光定量PCR检测方法,用于病原初步筛查。首先以BRV VP4作为目的基因,通过查询Genbank设计合成引物,然后将扩增的VP4基因片段克隆至pMD 18-T载体中,构建重组质粒标准品,最后经优化反应条件,建立了最低检测量可达7.21 copies/μl的EvaGreen荧光定量检测方法。经验证,该方法特异性好,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒及牛结核分枝杆菌的检测结果均为阴性;重复性较强,组内重复和组间重复变异系数分别为0.95%～1.12%和1.55%～2.18%。此外,利用该方法检测了21份ELISA阳性样本,测得阳性符合率为90.47 %。本研究建立的BVR VP4 RT-qPCR检测方法特异、敏感、可重复,可用于病原的快速检测,为BRV临床诊断提供了一种高效、可靠的检测方法。
【文章来源】：甘肃畜牧兽医. 2020,50(11)
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
VP4基因扩增条带
对建立的RT-qPCR反应条件进行优化,最佳反应条件:95 ℃预变性15 min;95 ℃变性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s,共40个循环;72 ℃再延伸10 min。以优化后的RT-qPCR检测5个不同浓度(10-1～103)的重组质粒pMD 18-T-VP4,其Ct值分别为29.02、25.35、20.78、17.86和14.73。得出标准曲线(见图2)。标准曲线的斜率为-3.425,截距为30.86,相关系数 R2=0.992,Ct值之间呈良好的线性关系。回归方程为Y=-3.425X+30.86;X为阳性质粒模板拷贝数以10为底的对数值。从而可以得出X与Ct值之间的线性关系曲线方程式为Ct=30.86-3.425X。不同浓度重组质粒的Ct值,从试验结果中直接读取,Ct值代入标准曲线方程可计算出VP4初始拷贝数。
BRV RT-q PCR特异性检测
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛病毒性腹泻病原的分子生物学与检测技术研究进展[J]. 耿金静,魏锁成. 西北民族大学学报(自然科学版). 2020(01)
[2]荧光定量PCR方法与其他动物疫病病原检测方法的应用比较[J]. 李桂黎,岳建国,李敏,周潇潇,李俐睿,肖金鹏,向晓雪. 四川畜牧兽医. 2019(02)
[3]A群牛轮状病毒的分子生物学研究进展[J]. 李凡,周芳,岳华,汤承. 动物医学进展. 2017(06)
[4]G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定[J]. 闻晓波,张玲玲,倪宏波,刘阳阳,曹思,冉旭华. 黑龙江八一农垦大学学报. 2016(04)
[5]牛轮状病毒引起的犊牛腹泻研究进展[J]. 常继涛,于力. 中国奶牛. 2016(02)
[6]牛轮状病毒VP7基因荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 魏锁成,巩转娣,车团结,田风林. 中国预防兽医学报. 2013(02)
[7]我国部分地区牛轮状病毒的病原学调查及一株G10P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定[J]. 常继涛,崔久辉,李建军,郭德瑞,王治才,于力. 中国预防兽医学报. 2008(10)
[8]VP7、VP4与轮状病毒装配及分子流行病学[J]. 高华英,孟红. 国际流行病学传染病学杂志. 2006(02)
[9]动物轮状病毒病的流行病学及综合防治[J]. 魏锁成. 甘肃畜牧兽医. 2005(03)
[10]福建省牛流行性腹泻病原—牛轮状病毒的研究[J]. 吴城,金学浩,曾广谧,葛颐昌,陈仁祥,黄纪铨,林禧龄,章连钧,俞贤康. 畜牧兽医学报. 1984(04)
博士论文
[1]益生菌对轮状病毒感染和腹泻的保护机制[D]. 刘芳宁.西北农林科技大学 2010
硕士论文
[1]中国部分地区A群牛轮状病毒VP6蛋白的分子特征及其应用研究[D]. 罗雪.西南民族大学 2019
[2]BRV与BCoV SYBR Green I RT-qPCR检测方法的建立及应用[D]. 曹禹.黑龙江八一农垦大学 2018
[3]人灭活轮状病毒疫苗诱导实验动物免疫应答研究[D]. 曹颖.昆明医科大学 2013
[4]犊牛腹泻轮状病毒分离鉴定及RT-LAMP检测方法的建立[D]. 李巍.河北农业大学 2012
[5]牛轮状病毒HQO9株的分离与鉴定[D]. 王鑫.东北农业大学 2012
本文编号：3356294
【文章来源】：甘肃畜牧兽医. 2020,50(11)
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
VP4基因扩增条带
对建立的RT-qPCR反应条件进行优化,最佳反应条件:95 ℃预变性15 min;95 ℃变性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s,共40个循环;72 ℃再延伸10 min。以优化后的RT-qPCR检测5个不同浓度(10-1～103)的重组质粒pMD 18-T-VP4,其Ct值分别为29.02、25.35、20.78、17.86和14.73。得出标准曲线(见图2)。标准曲线的斜率为-3.425,截距为30.86,相关系数 R2=0.992,Ct值之间呈良好的线性关系。回归方程为Y=-3.425X+30.86;X为阳性质粒模板拷贝数以10为底的对数值。从而可以得出X与Ct值之间的线性关系曲线方程式为Ct=30.86-3.425X。不同浓度重组质粒的Ct值,从试验结果中直接读取,Ct值代入标准曲线方程可计算出VP4初始拷贝数。
BRV RT-q PCR特异性检测
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛病毒性腹泻病原的分子生物学与检测技术研究进展[J]. 耿金静,魏锁成. 西北民族大学学报(自然科学版). 2020(01)
[2]荧光定量PCR方法与其他动物疫病病原检测方法的应用比较[J]. 李桂黎,岳建国,李敏,周潇潇,李俐睿,肖金鹏,向晓雪. 四川畜牧兽医. 2019(02)
[3]A群牛轮状病毒的分子生物学研究进展[J]. 李凡,周芳,岳华,汤承. 动物医学进展. 2017(06)
[4]G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定[J]. 闻晓波,张玲玲,倪宏波,刘阳阳,曹思,冉旭华. 黑龙江八一农垦大学学报. 2016(04)
[5]牛轮状病毒引起的犊牛腹泻研究进展[J]. 常继涛,于力. 中国奶牛. 2016(02)
[6]牛轮状病毒VP7基因荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 魏锁成,巩转娣,车团结,田风林. 中国预防兽医学报. 2013(02)
[7]我国部分地区牛轮状病毒的病原学调查及一株G10P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定[J]. 常继涛,崔久辉,李建军,郭德瑞,王治才,于力. 中国预防兽医学报. 2008(10)
[8]VP7、VP4与轮状病毒装配及分子流行病学[J]. 高华英,孟红. 国际流行病学传染病学杂志. 2006(02)
[9]动物轮状病毒病的流行病学及综合防治[J]. 魏锁成. 甘肃畜牧兽医. 2005(03)
[10]福建省牛流行性腹泻病原—牛轮状病毒的研究[J]. 吴城,金学浩,曾广谧,葛颐昌,陈仁祥,黄纪铨,林禧龄,章连钧,俞贤康. 畜牧兽医学报. 1984(04)
博士论文
[1]益生菌对轮状病毒感染和腹泻的保护机制[D]. 刘芳宁.西北农林科技大学 2010
硕士论文
[1]中国部分地区A群牛轮状病毒VP6蛋白的分子特征及其应用研究[D]. 罗雪.西南民族大学 2019
[2]BRV与BCoV SYBR Green I RT-qPCR检测方法的建立及应用[D]. 曹禹.黑龙江八一农垦大学 2018
[3]人灭活轮状病毒疫苗诱导实验动物免疫应答研究[D]. 曹颖.昆明医科大学 2013
[4]犊牛腹泻轮状病毒分离鉴定及RT-LAMP检测方法的建立[D]. 李巍.河北农业大学 2012
[5]牛轮状病毒HQO9株的分离与鉴定[D]. 王鑫.东北农业大学 2012
本文编号：3356294
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