半套式PCR技术检测土壤中弓形虫的研究
发布时间：2021-08-27 13:47
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种宿主广泛的寄生性原虫，能感染包括人类在内的多种温血动物，其引起的弓形虫病（toxoplasmosis）危害严重，对人类健康和畜牧业生产构成很大威胁。弓形虫病有多种传播途径，通过接触土壤而食入弓形虫卵囊是获得性感染的主要方式之一。卵囊随猫粪排入环境后，随着雨水冲刷和渗透作用在土壤中散播，进一步污染水源，成为弓形虫病的重要传染源。建立土壤中弓形虫检测方法并采集土样进行检测，了解土壤中弓形虫的分布情况，可以有效预防土源性弓形虫病的传播。从土壤中分离病原体后镜检或接种小鼠是以病原学为基础的检测方法，随着分子生物学的发展，以PCR为基础的基因扩增技术因特异性强、敏感性高、检测速度快等优点已广泛应用于土壤中弓形虫的检测。本研究以弓形虫529bp重复序列为靶基因，设计特异性引物，建立了土壤中弓形虫半套式PCR检测方法。该方法操作简单、重复性好，每克土壤中最低可检测到2个弓形虫卵囊，且与犬新孢子虫、牛微小隐孢子虫、鸡贝氏隐孢子虫、莫氏巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、中华泰勒虫、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、牛链球菌、猪链球菌、蒙氏肠球菌...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Summary
英文缩略词表
目录
引言
第一章 文献综述与研究内容
1.1 土壤中弓形虫研究现状
1.2 弓形虫 529 bp 基因序列的特征及其在研究中的应用
1.3 研究内容
第二章 土壤中弓形虫检测方法的建立
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 虫株、基因与载体
2.1.3 主要实验试剂
2.2 试验方法
2.2.1 弓形虫 RH 株速殖子培养
2.2.2 弓形虫 RH 株卵囊的培养、分离与纯化
2.2.3 弓形虫卵囊基因组 DNA 提取
2.2.4 引物设计
2.2.5 引物 TX1 与 TX3 退火温度探索
2.2.6 引物 TX2 与 TX3 退火温度探索
2.2.7 引物 TX1 浓度探索
2.2.8 模板浓度对普通 PCR 和半套式 PCR 反应的影响
2.2.9 半套式 PCR 检测方法的初步建立
2.2.10 普通 PCR 反应条件的优化
2.2.11 半套式 PCR 反应条件的优化
2.2.12 土壤中弓形虫检测方法的建立
2.2.13 构建阳性重组质粒并测序
2.2.14 特异性实验
2.2.15 敏感性试验
2.2.16 土壤样品检测试验
2.3 结果
2.3.1 引物 TX1 和 TX3 在不同退火温度下的扩增结果
2.3.2 引物 TX2 和 TX3 在不同退火温度下的扩增结果
2.3.3 引物 TX1 在不同浓度下的扩增结果
2.3.4 模板浓度对 PCR 反应的影响
2.3.5 普通 PCR 反应条件的优化
2.3.6 半套式 PCR 反应条件的优化
2.3.7 重组阳性质粒 PCR 鉴定结果
2.3.8 重组质粒测序结果
2.3.9 反应特异性鉴定结果
2.3.10 敏感性检测结果
2.3.11 土壤样品检测结果
2.3.12 阳性土壤样品 DNA 测序结果
2.4 讨论
第三章 半套式 PCR 检测方法在土壤检测中的应用
3.1 材料和方法
3.1.1 试剂
3.1.2 土壤样品采集
3.1.3 土壤中基因组 DNA 提取
3.1.4 方法
3.2 结果
3.3 讨论
第四章 研究结论
参考文献
致谢
作者简介
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]青海省互助县藏羊弓形虫血清学调查[J]. 李英,李增魁,康明,李永坚,刘李盛. 动物医学进展. 2010(07)
[2]弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立[J]. 李月梅,薛书江,其木格,邢莹,张守发. 畜牧与兽医. 2009(11)
[3]弓形虫半巢式PCR检测方法的建立[J]. 孔得翔,王素华,曲道峰,蔡渭明,杜爱芳. 中国兽医学报. 2009(01)
[4]犬和猫的弓形虫病[J]. 卓国荣,丁明星. 动物医学进展. 2007(S1)
[5]弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析[J]. 祁光宇,孙晓林,付宝权,王艳华,苟惠天,张德林. 甘肃农业大学学报. 2007(02)
[6]青海省弓形虫病流行病学调查[J]. 陆艳,李晓卉. 中国兽医杂志. 2005(02)
[7]提高PCR反应特异性的几点策略[J]. 李谦,李雅青. 临沂师范学院学报. 2001(04)
[8]弓形虫病研究九十年[J]. 崔君兆. 实用寄生虫病杂志. 2000(02)
本文编号：3366467
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Summary
英文缩略词表
目录
引言
第一章 文献综述与研究内容
1.1 土壤中弓形虫研究现状
1.2 弓形虫 529 bp 基因序列的特征及其在研究中的应用
1.3 研究内容
第二章 土壤中弓形虫检测方法的建立
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 虫株、基因与载体
2.1.3 主要实验试剂
2.2 试验方法
2.2.1 弓形虫 RH 株速殖子培养
2.2.2 弓形虫 RH 株卵囊的培养、分离与纯化
2.2.3 弓形虫卵囊基因组 DNA 提取
2.2.4 引物设计
2.2.5 引物 TX1 与 TX3 退火温度探索
2.2.6 引物 TX2 与 TX3 退火温度探索
2.2.7 引物 TX1 浓度探索
2.2.8 模板浓度对普通 PCR 和半套式 PCR 反应的影响
2.2.9 半套式 PCR 检测方法的初步建立
2.2.10 普通 PCR 反应条件的优化
2.2.11 半套式 PCR 反应条件的优化
2.2.12 土壤中弓形虫检测方法的建立
2.2.13 构建阳性重组质粒并测序
2.2.14 特异性实验
2.2.15 敏感性试验
2.2.16 土壤样品检测试验
2.3 结果
2.3.1 引物 TX1 和 TX3 在不同退火温度下的扩增结果
2.3.2 引物 TX2 和 TX3 在不同退火温度下的扩增结果
2.3.3 引物 TX1 在不同浓度下的扩增结果
2.3.4 模板浓度对 PCR 反应的影响
2.3.5 普通 PCR 反应条件的优化
2.3.6 半套式 PCR 反应条件的优化
2.3.7 重组阳性质粒 PCR 鉴定结果
2.3.8 重组质粒测序结果
2.3.9 反应特异性鉴定结果
2.3.10 敏感性检测结果
2.3.11 土壤样品检测结果
2.3.12 阳性土壤样品 DNA 测序结果
2.4 讨论
第三章 半套式 PCR 检测方法在土壤检测中的应用
3.1 材料和方法
3.1.1 试剂
3.1.2 土壤样品采集
3.1.3 土壤中基因组 DNA 提取
3.1.4 方法
3.2 结果
3.3 讨论
第四章 研究结论
参考文献
致谢
作者简介
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]青海省互助县藏羊弓形虫血清学调查[J]. 李英,李增魁,康明,李永坚,刘李盛. 动物医学进展. 2010(07)
[2]弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立[J]. 李月梅,薛书江,其木格,邢莹,张守发. 畜牧与兽医. 2009(11)
[3]弓形虫半巢式PCR检测方法的建立[J]. 孔得翔,王素华,曲道峰,蔡渭明,杜爱芳. 中国兽医学报. 2009(01)
[4]犬和猫的弓形虫病[J]. 卓国荣,丁明星. 动物医学进展. 2007(S1)
[5]弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析[J]. 祁光宇,孙晓林,付宝权,王艳华,苟惠天,张德林. 甘肃农业大学学报. 2007(02)
[6]青海省弓形虫病流行病学调查[J]. 陆艳,李晓卉. 中国兽医杂志. 2005(02)
[7]提高PCR反应特异性的几点策略[J]. 李谦,李雅青. 临沂师范学院学报. 2001(04)
[8]弓形虫病研究九十年[J]. 崔君兆. 实用寄生虫病杂志. 2000(02)
本文编号：3366467
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