小反刍兽疫病毒血凝素蛋白与宿主受体相互作用的研究
发布时间：2021-08-27 22:14
小反刍兽疫（Peste des petitus ruminants，PPR）的流行加剧了欠发达国家的贫困，严重影响了动物健康与食品安全，联合国粮农组织（Food andAgriculture Organization of the UnitedNations, FAO）于2012年提出开启全球范围的多国家多地区全方位合作，从而控制和消灭PPR。然而，小反刍兽疫病毒（Peste des petitus ruminants virus，PPRV）的基础研究还很薄弱，近年来PPRV跨地区跨国界传播以及感染野生动物，给全球消灭计划提出了严峻挑战。基于对同属麻疹病毒（Measles virus, MV）的研究证实，与受体的相互作用，不仅是病毒入侵宿主的第一步，也是导致宿主机体组织病理变化分布、宿主呈现临床症状表现的重要原因。下面几个问题值得关注：PPRV除了同MV一样利用SLAM作为受体开启病毒的入侵，是否也同样利用宿主呼吸道等上皮细胞基底层的Nectin4分子作为受体从而介导子代病毒的排出？PPRV疫苗株不具备向外“排毒”的特点，是否因为其不能与Nectin4结合？PPRV利用病毒囊膜上的血凝...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：145 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 综述
1.1 PPRV研究进展
1.1.1 形态学与基因组结构
1.1.2 病毒的复制与毒力
1.1.3 病毒的进化与分型
1.2 PPR研究进展
1.2.1 临床症状与病理学研究
1.2.2 流行与分布
1.2.3 防控与消灭计划
1.3 MV受体研究进展
1.3.1 MV受体的发现
1.3.2 MV-H与各受体作用模式
1.3.3 MV-H与受体相互作用在病毒复制中的作用
1.4 分子模拟技术研究进展
1.4.1 分子模拟技术的发展
1.4.2 分子模拟技术在本研究中运用的基础平台
1.4.3 分子模拟的局限与展望
第二章 绵羊Nectin4 基因的克隆与表达
摘要
2.1 材料
2.1.1 动物与组织
2.1.2 参考序列及引物设计软件
2.1.3 载体、菌株和细胞
2.1.4 主要试剂及酶
2.1.5 培养基及溶液的配制
2.2 方法
2.2.1 绵羊肺支气管总RNA的提取
2.2.2 绵羊Nectin4 基因的巢式RT-PCR扩增
2.2.3 PCR产物的T载体克隆
2.2.4 绵羊Nectin4 基因真核表达载体的构建
2.2.5 Nectin4 蛋白的真核表达
2.3 结果
2.3.1 绵羊Nectin4 基因第一轮PCR的扩增
2.3.2 绵羊Nectin4 基因第二轮PCR的扩增
2.3.3 阳性克隆中Nectin4 基因的扩增
2.3.4 重组表达质粒pCMV-Myc-Nectin4 的构建与鉴定
2.3.5 Nectin4 基因表达的免疫荧光检测
2.3.6 Nectin4 蛋白的Western blotting鉴定
2.4 讨论
第三章 PPRV H-野毒和PPRV H-疫苗的克隆与表达
摘要
3.1 材料
3.1.1 载体、菌株和细胞
3.1.2 主要试剂及酶
3.1.3 培养基及溶液的配制
3.2 方法
3.2.1 PPRV Hw与PPRV Hv全长的PCR扩增
3.2.2 Hw和Hv基因真核表达载体的构建
3.2.3 Hw和Hv蛋白的真核表达与检测
3.3 结果
3.3.1 PPRV Hw重组质粒的构建与蛋白表达
3.3.2 PPRV Hv重组质粒的构建与蛋白表达
3.4 讨论
第四章 同源建模法预测PPRV Hw／PPRV Hv与羊源Nectin4／SLAM的相互作用
摘要
4.1 材料
4.1.1 服务器
4.1.2 软件
4.1.3 序列
4.2 方法
4.2.1 复合物同源建模
4.2.2 相互作用能计算
4.2.3 虚拟氨基酸突变
4.3 结果
4.3.1 PPRV Hw-羊源SLAM复合物结构的解析
4.3.2 PPRV Hv-羊源SLAM复合物结构的解析
4.3.3 羊源SLAM分别与PPRV Hw、PPRV Hv相互作用能的比较
4.3.4 羊源SLAM分别与PPRV Hw、PPRV Hv相互作用关键AA的预测
4.3.5 PPRV Hw-羊源Nectin4 复合物结构的解析
4.3.6 PPRV Hv-羊源Nectin4 复合物结构的解析
4.3.7 羊源Nectin4 分别与PPRV Hw、PPRV Hv相互作用能的比较
4.3.8 羊源Nectin4 分别与PPRV Hw、PPRV Hv相互作用关键AA的预测
4.3.9 PPRV Hw分别与羊源SLAM、羊源Nectin4 相互作用的差异
4.3.10 PPRV Hv分别与羊源SLAM、羊源Nectin4 相互作用的差异
4.4 讨论
第五章 PPRV H与羊源Nectin4 的相互作用
摘要
5.1 材料与方法
5.1.1 动物与组织
5.1.2 病毒、细胞、菌株和载体
5.1.3 主要试剂及酶
5.1.4 培养基及溶液的配制
5.1.5 PPRV Hw和PPRV Hv胞外区真核表达质粒的构建
5.1.6 羊源Nectin4 胞外区真核表达质粒的构建
5.1.7 质粒共转染
5.1.8 间接免疫荧光
5.1.9 Western Blotting检测
5.1.10 激光共聚焦观察定位
5.1.11 Co-Ip实验
5.1.12 病毒感染实验
5.1.13 荧光定量PCR检测Nectin4 在绵羊各组织中的分布
5.2 结果
5.2.1 pCDNA3-Flag-bwHw、pCDNA3-Flag-bwHv和pCMV-Myc-bwNectin4c重组质粒的构建与鉴定
5.2.2 bwHw、bwHv和bwNectin4 蛋白的表达
5.2.3 bwHw与bwNectin4、bwHv与bwNectin4 在CHO细胞共定位
5.2.4 PPRV野毒株和疫苗株H蛋白均可与羊源Nectin4 蛋白相互作用
5.2.5 Nectin4 可提高PPRV在Vero细胞中的繁殖
5.2.6 PPRV的组织嗜性与Nectin4 在绵羊的组织分布具有相关性
5.3 讨论
第六章 PPRV Hw与绵羊Nectin4 相互作用关键区域和关键氨基酸的鉴定
摘要
6.1 材料和方法
6.1.1 细胞、菌株和载体
6.1.2 主要试剂及酶
6.1.3 相互作用区域重组质粒（pCMV-Myc-zjNectin4）的构建
6.1.4 点突变质粒的构建与鉴定
6.1.5 pCMV-Myc-zjNectin4 与pCDNA3-Flag-bwHw质粒的共表达
6.1.6 点突变质粒与pCMV-Myc-bwNectin4 质粒的共表达
6.1.7 激光共聚焦观察共定位
6.1.8 Co-Ip实验
6.2 结果
6.2.1 zjNectin4 能与PPRV Hw相互作用
6.2.2 五个PPRV bwHw点突变体均能与bwNectin4 相互作用
6.3 讨论
第七章 H蛋白对PPRV宿主嗜性影响的分析
摘要
7.1 材料和方法
7.1.1 服务器
7.1.2 软件
7.1.3 序列
7.1.4 复合物同源建模
7.1.5 相互作用能计算
7.1.6 虚拟氨基酸突变
7.2 结果
7.2.1 PPRV Hw/Hv分别与人源SLAM复合物的构建
7.2.2 PPRV Hw/Hv分别与人源SLAM相互作用能力的分析
7.2.3 预测增强人源SLAM与PPRV Hw/Hv相互作用能力的突变
7.3 讨论
第八章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]Rethinking quasispecies theory: From fittest type to cooperative consortia[J]. Luis P Villarreal,Guenther Witzany. World Journal of Biological Chemistry. 2013(04)
[2]麻疹病毒受体与病毒侵入[J]. 逯光文,高福,严景华. 生物工程学报. 2013(01)
[3]Evaluation of Efficacy of Stabilizers on the Thermostability of Live Attenuated Thermo-adapted Peste des petits ruminants Vaccines[J]. Thachamvally Riyesh,Vinayagamurthy Balamurugan,Arnab Sen,Veerakyathappa Bhanuprakash,Gnanavel Venkatesan,Vinita Yadav,Raj Kumar Singh. Virologica Sinica. 2011(05)
[4]小反刍兽疫的研究进展[J]. 骆学农,郑亚东,才学鹏. 中国兽医科学. 2007(11)
博士论文
[1]小反刍兽疫病毒样颗粒的装配与释放研究[D]. 王秋霞.中国农业科学院 2013
[2]小反刍兽疫病毒血凝素蛋白及其受体的研究[D]. 蒙学莲.中国农业科学院 2012
本文编号：3367194
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：145 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 综述
1.1 PPRV研究进展
1.1.1 形态学与基因组结构
1.1.2 病毒的复制与毒力
1.1.3 病毒的进化与分型
1.2 PPR研究进展
1.2.1 临床症状与病理学研究
1.2.2 流行与分布
1.2.3 防控与消灭计划
1.3 MV受体研究进展
1.3.1 MV受体的发现
1.3.2 MV-H与各受体作用模式
1.3.3 MV-H与受体相互作用在病毒复制中的作用
1.4 分子模拟技术研究进展
1.4.1 分子模拟技术的发展
1.4.2 分子模拟技术在本研究中运用的基础平台
1.4.3 分子模拟的局限与展望
第二章 绵羊Nectin4 基因的克隆与表达
摘要
2.1 材料
2.1.1 动物与组织
2.1.2 参考序列及引物设计软件
2.1.3 载体、菌株和细胞
2.1.4 主要试剂及酶
2.1.5 培养基及溶液的配制
2.2 方法
2.2.1 绵羊肺支气管总RNA的提取
2.2.2 绵羊Nectin4 基因的巢式RT-PCR扩增
2.2.3 PCR产物的T载体克隆
2.2.4 绵羊Nectin4 基因真核表达载体的构建
2.2.5 Nectin4 蛋白的真核表达
2.3 结果
2.3.1 绵羊Nectin4 基因第一轮PCR的扩增
2.3.2 绵羊Nectin4 基因第二轮PCR的扩增
2.3.3 阳性克隆中Nectin4 基因的扩增
2.3.4 重组表达质粒pCMV-Myc-Nectin4 的构建与鉴定
2.3.5 Nectin4 基因表达的免疫荧光检测
2.3.6 Nectin4 蛋白的Western blotting鉴定
2.4 讨论
第三章 PPRV H-野毒和PPRV H-疫苗的克隆与表达
摘要
3.1 材料
3.1.1 载体、菌株和细胞
3.1.2 主要试剂及酶
3.1.3 培养基及溶液的配制
3.2 方法
3.2.1 PPRV Hw与PPRV Hv全长的PCR扩增
3.2.2 Hw和Hv基因真核表达载体的构建
3.2.3 Hw和Hv蛋白的真核表达与检测
3.3 结果
3.3.1 PPRV Hw重组质粒的构建与蛋白表达
3.3.2 PPRV Hv重组质粒的构建与蛋白表达
3.4 讨论
第四章 同源建模法预测PPRV Hw／PPRV Hv与羊源Nectin4／SLAM的相互作用
摘要
4.1 材料
4.1.1 服务器
4.1.2 软件
4.1.3 序列
4.2 方法
4.2.1 复合物同源建模
4.2.2 相互作用能计算
4.2.3 虚拟氨基酸突变
4.3 结果
4.3.1 PPRV Hw-羊源SLAM复合物结构的解析
4.3.2 PPRV Hv-羊源SLAM复合物结构的解析
4.3.3 羊源SLAM分别与PPRV Hw、PPRV Hv相互作用能的比较
4.3.4 羊源SLAM分别与PPRV Hw、PPRV Hv相互作用关键AA的预测
4.3.5 PPRV Hw-羊源Nectin4 复合物结构的解析
4.3.6 PPRV Hv-羊源Nectin4 复合物结构的解析
4.3.7 羊源Nectin4 分别与PPRV Hw、PPRV Hv相互作用能的比较
4.3.8 羊源Nectin4 分别与PPRV Hw、PPRV Hv相互作用关键AA的预测
4.3.9 PPRV Hw分别与羊源SLAM、羊源Nectin4 相互作用的差异
4.3.10 PPRV Hv分别与羊源SLAM、羊源Nectin4 相互作用的差异
4.4 讨论
第五章 PPRV H与羊源Nectin4 的相互作用
摘要
5.1 材料与方法
5.1.1 动物与组织
5.1.2 病毒、细胞、菌株和载体
5.1.3 主要试剂及酶
5.1.4 培养基及溶液的配制
5.1.5 PPRV Hw和PPRV Hv胞外区真核表达质粒的构建
5.1.6 羊源Nectin4 胞外区真核表达质粒的构建
5.1.7 质粒共转染
5.1.8 间接免疫荧光
5.1.9 Western Blotting检测
5.1.10 激光共聚焦观察定位
5.1.11 Co-Ip实验
5.1.12 病毒感染实验
5.1.13 荧光定量PCR检测Nectin4 在绵羊各组织中的分布
5.2 结果
5.2.1 pCDNA3-Flag-bwHw、pCDNA3-Flag-bwHv和pCMV-Myc-bwNectin4c重组质粒的构建与鉴定
5.2.2 bwHw、bwHv和bwNectin4 蛋白的表达
5.2.3 bwHw与bwNectin4、bwHv与bwNectin4 在CHO细胞共定位
5.2.4 PPRV野毒株和疫苗株H蛋白均可与羊源Nectin4 蛋白相互作用
5.2.5 Nectin4 可提高PPRV在Vero细胞中的繁殖
5.2.6 PPRV的组织嗜性与Nectin4 在绵羊的组织分布具有相关性
5.3 讨论
第六章 PPRV Hw与绵羊Nectin4 相互作用关键区域和关键氨基酸的鉴定
摘要
6.1 材料和方法
6.1.1 细胞、菌株和载体
6.1.2 主要试剂及酶
6.1.3 相互作用区域重组质粒（pCMV-Myc-zjNectin4）的构建
6.1.4 点突变质粒的构建与鉴定
6.1.5 pCMV-Myc-zjNectin4 与pCDNA3-Flag-bwHw质粒的共表达
6.1.6 点突变质粒与pCMV-Myc-bwNectin4 质粒的共表达
6.1.7 激光共聚焦观察共定位
6.1.8 Co-Ip实验
6.2 结果
6.2.1 zjNectin4 能与PPRV Hw相互作用
6.2.2 五个PPRV bwHw点突变体均能与bwNectin4 相互作用
6.3 讨论
第七章 H蛋白对PPRV宿主嗜性影响的分析
摘要
7.1 材料和方法
7.1.1 服务器
7.1.2 软件
7.1.3 序列
7.1.4 复合物同源建模
7.1.5 相互作用能计算
7.1.6 虚拟氨基酸突变
7.2 结果
7.2.1 PPRV Hw/Hv分别与人源SLAM复合物的构建
7.2.2 PPRV Hw/Hv分别与人源SLAM相互作用能力的分析
7.2.3 预测增强人源SLAM与PPRV Hw/Hv相互作用能力的突变
7.3 讨论
第八章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]Rethinking quasispecies theory: From fittest type to cooperative consortia[J]. Luis P Villarreal,Guenther Witzany. World Journal of Biological Chemistry. 2013(04)
[2]麻疹病毒受体与病毒侵入[J]. 逯光文,高福,严景华. 生物工程学报. 2013(01)
[3]Evaluation of Efficacy of Stabilizers on the Thermostability of Live Attenuated Thermo-adapted Peste des petits ruminants Vaccines[J]. Thachamvally Riyesh,Vinayagamurthy Balamurugan,Arnab Sen,Veerakyathappa Bhanuprakash,Gnanavel Venkatesan,Vinita Yadav,Raj Kumar Singh. Virologica Sinica. 2011(05)
[4]小反刍兽疫的研究进展[J]. 骆学农,郑亚东,才学鹏. 中国兽医科学. 2007(11)
博士论文
[1]小反刍兽疫病毒样颗粒的装配与释放研究[D]. 王秋霞.中国农业科学院 2013
[2]小反刍兽疫病毒血凝素蛋白及其受体的研究[D]. 蒙学莲.中国农业科学院 2012
本文编号：3367194
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