1株乳源蜡样芽胞杆菌的分离鉴定及致病性分析
发布时间：2021-08-29 11:12
无菌采集重庆市某奶牛场乳房炎患牛奶样,利用MYP选择培养基无菌分离培养得到1株疑似蜡样芽孢杆菌的纯培养物,利用全自动微生物鉴定系统、16S rRNA、KB法药敏试验、MLST分型和PCR扩增hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM、Ces毒力基因及测序,并通过测定小鼠LD50,血清ALT、AST、LDH和ALP活性,肝脏组织SOD、MDA、GSH-Px水平及病变组织病理组织学观察进行分析鉴定。结果显示,分离株在甘露醇卵黄多黏菌素琼脂（MYP）平板上,形成周围有白色至淡粉红色的菌落,在蜡样芽孢杆菌显色培养基上形成具有白色光晕的蓝色菌落,革兰染色阳性。全自动微生物鉴定系统鉴定为蜡样芽孢杆菌,鉴定可信度为99.9%,典型度为132 （典型）。16S rRNA序列与与韩国（FJ982661.1）、美国（NZJURK01000037.1）、斯里兰卡（MG827268.1）、马来西亚（MN093796.1）株同源性为100%,同美国奶源分离株（NZASPZ01000016.1）亲缘关系最近。药...
【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(08)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
Bc分离株的生长及染色特性
以分离菌基因组DNA为模板,分别以hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM、Ces基因引物序列进行PCR扩增,扩增产物电泳检测,结果hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM基因扩增片段分别为480,750,550,300,730,400,800,1 200 bp,同预期片段大小一致;没有扩增出Ces基因的目的片段(图5)。对扩增产物测序结果表明,nheA基因片段同日本分离的炭疽杆菌(AP019731.1)毒力基因同源性高达96.91%,entFM基因片段同美国Bc(CP001186.1)同源性为97.45%,nheB基因片段同挪威Bc(CP001283.1)同源性高达95.48%,其他基因测序结果表明均为Bc毒力相关基因(表4)。表2 分离菌株的药物敏感性试验结果 mm 抗菌药物 抑菌圈直径敏感性标准 抑菌圈直径 敏感性 耐药(R) 中敏(I) 敏感(S) 复方新诺明 ≤10 11～15 ≥16 21 S 大观霉素 ≤14 15～17 ≥18 13 R 诺氟沙星 ≤12 13～16 ≥17 19 S 呋喃妥因 ≤14 15～16 ≥17 16 I 苯唑西林 ≤10 11～12 ≥13 30 S 米诺环素 ≤14 13～18 ≥19 27 S 万古霉素 ≤14 - ≥15 14 R 四环素 ≤14 15～18 ≥19 23 S 环丙沙星 ≤15 16～20 ≥21 26 S 青霉素G ≤28 - ≥29 42 S 克林霉素 ≤14 15～20 ≥21 26 S 多粘菌素B ≤8 9～11 ≥12 0 R 红霉素 ≤13 14～22 ≥23 25 S 克拉霉素 ≤13 14～17 ≥18 25 S 氯霉素 ≤12 13～17 ≥18 18 S 左氟沙星 ≤13 14～16 ≥17 23 S
攻毒后小鼠均出现不同程度的腹泻、采食量下降、被毛松乱、精神沉郁、嗜睡等症状。攻毒后5 d最高剂量组(4×1011 CFU/mL)小鼠开始出现死亡,攻毒后10 d最高剂量组小鼠全部死亡。次剂量组(4×1010 CFU/mL和4×109CFU/mL),分别死亡8只和6只,死亡时间主要集中在攻毒后11～13 d。最低剂量组(4×108 CFU/mL)未出现死亡,对照组小鼠未发病和死亡。采用Reed-Muench法计算该分离菌LD50为 1.44×1010 CFU。剖检发病死亡小鼠,发现肝表面颜色变淡,肿大、质脆,呈黄白色,剂量越大,颜色越淡,有的出现明显散在坏死灶;脾脏肿大,充血;肺脏有出血坏死;心肌变性坏死;肠道黏膜脱落,肠道内充满黄褐色水样液体等病变特征;同剂量组死亡小鼠中,经腹腔注射攻毒小鼠病变更加明显。无菌条件下采集病死小鼠肝脏、肠内容物及肺脏中均分离出目的细菌,经菌落PCR扩增,PCR产物测序,比对为目的菌。与正常对照组比较,不同剂量Bc攻毒组小鼠血清ALT、AST、LDH及ALP含量均明显升高,差异显著 (P<0.05 )。与正常对照组比较,不同剂量Bc攻毒组小鼠肝脏组织SOD、GSH-PX含量明显降低,MDA含量显著升高,差异显著(P<0.05)(表5)。对次剂量组(4×1010 CFU/mL)小鼠剖检,取肝脏经HE染色观察正常组小鼠肝中央静脉、肝血窦结构清晰,肝细胞无坏死、变性。攻毒组肝细胞肿大、肝索排列紊乱,肝细胞空泡变性,肝血窦变窄;肠黏膜脱落,变性坏死;肾间质淤血,肾小管上皮细胞脱落,近曲小管上皮细胞坏死、脱落及出现蛋白管型,肾小囊腔增宽、出血等(图6)。表3 Pubmlst数据库Bc 20株ST型 ST glpF gmK ilvD pta pur pycA tpi 克隆复合物 476 127 27 134 126 131 42 100 1341 127 27 276 126 131 42 100 1813 127 27 209 126 131 42 100 2327 127 27 276 184 131 169 100 2350 127 27 134 184 131 42 100 74 42 27 37 41 40 42 32 764 178 27 209 184 131 169 100 825 178 27 209 184 131 42 100 1815 178 27 209 14 9 169 7 1832 178 27 209 126 131 42 100 2214 183 27 276 184 244 42 88 1342 229 5 271 126 16 183 190 1230 13 8 8 11 131 12 10 ST-142 complex 1231 40 9 14 12 131 25 7 ST-18 complex 2033 15 7 7 2 131 8 13 ST-23 complex 950 221 131 247 227 211 42 177 771 197 117 225 204 191 172 100 1759 197 117 316 204 191 6 100 1826 197 117 316 204 191 172 100 2090 197 117 373 204 191 172 100
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国部分地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 杜琳,王丽芳,冯小慧,张三粉,宋洁,姚一萍,史培,申捷. 动物医学进展. 2018(03)
[2]天鹅源丙型副伤寒沙门菌对小鼠的致病性[J]. 冉丹丹,陈冬平,罗薇,孔雪英,刘群. 中国兽医学报. 2016(12)
[3]检测水貂出血性肺炎绿脓杆菌的比色LAMP法的建立与应用[J]. 韩明明,刘旭平,母连志,赵静,刘慧,刘晓飞. 中国兽医学报. 2014(04)
[4]2012年奶牛乳房炎防治技术研究进展[J]. 王旭荣,李建喜,杨志强. 中国畜牧杂志. 2013(24)
硕士论文
[1]婴幼儿食品中呕吐型蜡样芽孢杆菌的鉴别与多位点序列分析[D]. 张翼.武汉轻工大学 2015
本文编号：3370546
【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(08)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
Bc分离株的生长及染色特性
以分离菌基因组DNA为模板,分别以hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM、Ces基因引物序列进行PCR扩增,扩增产物电泳检测,结果hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM基因扩增片段分别为480,750,550,300,730,400,800,1 200 bp,同预期片段大小一致;没有扩增出Ces基因的目的片段(图5)。对扩增产物测序结果表明,nheA基因片段同日本分离的炭疽杆菌(AP019731.1)毒力基因同源性高达96.91%,entFM基因片段同美国Bc(CP001186.1)同源性为97.45%,nheB基因片段同挪威Bc(CP001283.1)同源性高达95.48%,其他基因测序结果表明均为Bc毒力相关基因(表4)。表2 分离菌株的药物敏感性试验结果 mm 抗菌药物 抑菌圈直径敏感性标准 抑菌圈直径 敏感性 耐药(R) 中敏(I) 敏感(S) 复方新诺明 ≤10 11～15 ≥16 21 S 大观霉素 ≤14 15～17 ≥18 13 R 诺氟沙星 ≤12 13～16 ≥17 19 S 呋喃妥因 ≤14 15～16 ≥17 16 I 苯唑西林 ≤10 11～12 ≥13 30 S 米诺环素 ≤14 13～18 ≥19 27 S 万古霉素 ≤14 - ≥15 14 R 四环素 ≤14 15～18 ≥19 23 S 环丙沙星 ≤15 16～20 ≥21 26 S 青霉素G ≤28 - ≥29 42 S 克林霉素 ≤14 15～20 ≥21 26 S 多粘菌素B ≤8 9～11 ≥12 0 R 红霉素 ≤13 14～22 ≥23 25 S 克拉霉素 ≤13 14～17 ≥18 25 S 氯霉素 ≤12 13～17 ≥18 18 S 左氟沙星 ≤13 14～16 ≥17 23 S
攻毒后小鼠均出现不同程度的腹泻、采食量下降、被毛松乱、精神沉郁、嗜睡等症状。攻毒后5 d最高剂量组(4×1011 CFU/mL)小鼠开始出现死亡,攻毒后10 d最高剂量组小鼠全部死亡。次剂量组(4×1010 CFU/mL和4×109CFU/mL),分别死亡8只和6只,死亡时间主要集中在攻毒后11～13 d。最低剂量组(4×108 CFU/mL)未出现死亡,对照组小鼠未发病和死亡。采用Reed-Muench法计算该分离菌LD50为 1.44×1010 CFU。剖检发病死亡小鼠,发现肝表面颜色变淡,肿大、质脆,呈黄白色,剂量越大,颜色越淡,有的出现明显散在坏死灶;脾脏肿大,充血;肺脏有出血坏死;心肌变性坏死;肠道黏膜脱落,肠道内充满黄褐色水样液体等病变特征;同剂量组死亡小鼠中,经腹腔注射攻毒小鼠病变更加明显。无菌条件下采集病死小鼠肝脏、肠内容物及肺脏中均分离出目的细菌,经菌落PCR扩增,PCR产物测序,比对为目的菌。与正常对照组比较,不同剂量Bc攻毒组小鼠血清ALT、AST、LDH及ALP含量均明显升高,差异显著 (P<0.05 )。与正常对照组比较,不同剂量Bc攻毒组小鼠肝脏组织SOD、GSH-PX含量明显降低,MDA含量显著升高,差异显著(P<0.05)(表5)。对次剂量组(4×1010 CFU/mL)小鼠剖检,取肝脏经HE染色观察正常组小鼠肝中央静脉、肝血窦结构清晰,肝细胞无坏死、变性。攻毒组肝细胞肿大、肝索排列紊乱,肝细胞空泡变性,肝血窦变窄;肠黏膜脱落,变性坏死;肾间质淤血,肾小管上皮细胞脱落,近曲小管上皮细胞坏死、脱落及出现蛋白管型,肾小囊腔增宽、出血等(图6)。表3 Pubmlst数据库Bc 20株ST型 ST glpF gmK ilvD pta pur pycA tpi 克隆复合物 476 127 27 134 126 131 42 100 1341 127 27 276 126 131 42 100 1813 127 27 209 126 131 42 100 2327 127 27 276 184 131 169 100 2350 127 27 134 184 131 42 100 74 42 27 37 41 40 42 32 764 178 27 209 184 131 169 100 825 178 27 209 184 131 42 100 1815 178 27 209 14 9 169 7 1832 178 27 209 126 131 42 100 2214 183 27 276 184 244 42 88 1342 229 5 271 126 16 183 190 1230 13 8 8 11 131 12 10 ST-142 complex 1231 40 9 14 12 131 25 7 ST-18 complex 2033 15 7 7 2 131 8 13 ST-23 complex 950 221 131 247 227 211 42 177 771 197 117 225 204 191 172 100 1759 197 117 316 204 191 6 100 1826 197 117 316 204 191 172 100 2090 197 117 373 204 191 172 100
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国部分地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 杜琳,王丽芳,冯小慧,张三粉,宋洁,姚一萍,史培,申捷. 动物医学进展. 2018(03)
[2]天鹅源丙型副伤寒沙门菌对小鼠的致病性[J]. 冉丹丹,陈冬平,罗薇,孔雪英,刘群. 中国兽医学报. 2016(12)
[3]检测水貂出血性肺炎绿脓杆菌的比色LAMP法的建立与应用[J]. 韩明明,刘旭平,母连志,赵静,刘慧,刘晓飞. 中国兽医学报. 2014(04)
[4]2012年奶牛乳房炎防治技术研究进展[J]. 王旭荣,李建喜,杨志强. 中国畜牧杂志. 2013(24)
硕士论文
[1]婴幼儿食品中呕吐型蜡样芽孢杆菌的鉴别与多位点序列分析[D]. 张翼.武汉轻工大学 2015
本文编号：3370546
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