产气荚膜梭菌plc和NetB基因重组植物乳酸杆菌构建及其免疫保护研究
发布时间：2021-08-31 08:11
鸡坏死性肠炎（Necrotic enteritis, NE）义称鸡肠毒血.症,是由A或C型产气荚膜梭菌引起鸡的一种以小肠后段肠管增粗和黏膜坏死为病变特征的急性细菌性传染病,对全球家禽生产造成重大的经济影响。本试验选择产气家膜梭菌两个关键致病因子a毒素/磷脂酶C（a-toxin/plc）和坏死性肠炎毒素B（NetB）为抗原,构建产气荚膜梭菌plc和NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌,通过乳酸菌可表达和传递外源抗原以及乳酸菌本身可在肠道定植的特性,有效刺激肠道黏膜免疫系统,进行鸡产气家膜梭菌新型疫苗保护机制的研究。本文利用植物乳酸菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）并进行SppIP诱导表达.Western Blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,plc和NetB重组蛋白相对分子质量分别为40kDa和36kDa。重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB分别电转化植物乳杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
1.1 鸡坏死性肠炎
1.1.1 病原及相关毒力因子
1.1.2 鸡坏死性肠炎诱发因素
1.1.3 鸡坏死性肠炎流行特点
1.1.4 鸡坏死性肠炎的临床症状
1.1.5 鸡坏死性肠炎病理变化
1.2 鸡坏死性肠炎疫苗的研究进展
1.2.1 类毒素疫苗
1.2.2 弱毒疫苗
1.2.3 基因工程疫苗
1.3 乳酸菌作为口服疫苗传递载体研究进展
1.3.1 乳酸菌对机体免疫作用的影响
1.3.2 乳酸菌作为口服疫苗传递载体的应用前景
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌株及质粒
2.1.3 培养基和主要试剂
2.1.4 主要试剂配制
2.1.5 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 表达产气荚膜梭菌plc和NetB蛋白重组质粒的构建 #
2.2.2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB鉴定
2.2.3 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB在大肠杆菌中诱导表达
2.2.4 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB在植物乳杆菌中诱导表达
2.2.5 产气荚膜梭菌plc和NetB基因重组植物乳杆菌的免疫保护试验
3 结果
3.1 PCR扩增plc基因与NetB基因
3.2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB鉴定
3.2.1 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB PCR鉴定
3.2.2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB双酶切鉴定
3.2.3 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB序列测定
3.3 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
3.3.1 重组plc蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
3.3.2 重组NetB蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
3.4 重组蛋白在植物乳杆菌中的诱导表达
3.4.1 表达plc/NetB重组植物乳杆菌PCR鉴定
3.4.2 表达plc/NetB重组植物乳杆菌Western Blot鉴定
3.4.3 表达plc/NetB重组植物乳杆菌间接免疫荧光鉴定
3.5 重组植物乳杆菌的免疫保护效果
3.5.1 重组植物乳杆菌在免疫鸡肠道定植情况
3.5.2 雏鸡免疫后抗产气荚膜梭菌plc、NetB抗体动态变化
3.5.3 雏鸡攻菌后抗产气荚膜梭菌plc、NetB抗体动态变化
3.5.4 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后细菌计数
3.5.5 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后病理剖检变化
3.5.6 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后病理组织学变化
3.5.7 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后肠道病变评分
3.5.8 重组物乳杆菌免疫及攻菌对雏鸡体重的影响
3.5.9 重组植物乳杆菌免疫菌对雏鸡免疫器官发育的影响
4 讨论
4.1 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB的构建
4.2 重组蛋白plc与NetB在大肠杆菌和乳酸菌中的表达
4.3 重组植物乳标菌抗产气荚膜梭菌感染免疫效果
4.3.1 免疫雏鸡攻凶后产气荚膜梭菌凶plc、NetB抗体动态变化
4.3.2 免疫鸡攻菌后机体病理损伤、细菌定植变化
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3374545
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
1.1 鸡坏死性肠炎
1.1.1 病原及相关毒力因子
1.1.2 鸡坏死性肠炎诱发因素
1.1.3 鸡坏死性肠炎流行特点
1.1.4 鸡坏死性肠炎的临床症状
1.1.5 鸡坏死性肠炎病理变化
1.2 鸡坏死性肠炎疫苗的研究进展
1.2.1 类毒素疫苗
1.2.2 弱毒疫苗
1.2.3 基因工程疫苗
1.3 乳酸菌作为口服疫苗传递载体研究进展
1.3.1 乳酸菌对机体免疫作用的影响
1.3.2 乳酸菌作为口服疫苗传递载体的应用前景
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌株及质粒
2.1.3 培养基和主要试剂
2.1.4 主要试剂配制
2.1.5 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 表达产气荚膜梭菌plc和NetB蛋白重组质粒的构建 #
2.2.2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB鉴定
2.2.3 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB在大肠杆菌中诱导表达
2.2.4 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB在植物乳杆菌中诱导表达
2.2.5 产气荚膜梭菌plc和NetB基因重组植物乳杆菌的免疫保护试验
3 结果
3.1 PCR扩增plc基因与NetB基因
3.2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB鉴定
3.2.1 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB PCR鉴定
3.2.2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB双酶切鉴定
3.2.3 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB序列测定
3.3 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
3.3.1 重组plc蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
3.3.2 重组NetB蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
3.4 重组蛋白在植物乳杆菌中的诱导表达
3.4.1 表达plc/NetB重组植物乳杆菌PCR鉴定
3.4.2 表达plc/NetB重组植物乳杆菌Western Blot鉴定
3.4.3 表达plc/NetB重组植物乳杆菌间接免疫荧光鉴定
3.5 重组植物乳杆菌的免疫保护效果
3.5.1 重组植物乳杆菌在免疫鸡肠道定植情况
3.5.2 雏鸡免疫后抗产气荚膜梭菌plc、NetB抗体动态变化
3.5.3 雏鸡攻菌后抗产气荚膜梭菌plc、NetB抗体动态变化
3.5.4 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后细菌计数
3.5.5 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后病理剖检变化
3.5.6 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后病理组织学变化
3.5.7 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后肠道病变评分
3.5.8 重组物乳杆菌免疫及攻菌对雏鸡体重的影响
3.5.9 重组植物乳杆菌免疫菌对雏鸡免疫器官发育的影响
4 讨论
4.1 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB的构建
4.2 重组蛋白plc与NetB在大肠杆菌和乳酸菌中的表达
4.3 重组植物乳标菌抗产气荚膜梭菌感染免疫效果
4.3.1 免疫雏鸡攻凶后产气荚膜梭菌凶plc、NetB抗体动态变化
4.3.2 免疫鸡攻菌后机体病理损伤、细菌定植变化
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3374545
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3374545.html
