河南PCV2株的分离鉴定及增殖敏感PK15细胞系的克隆与筛选

发布时间：2021-09-02 17:27

　　PCV2是圆环病毒科家族成员之一,无囊膜,单股环状DNA病毒。基因全长1767-1768bp。在其反义方向有两个主要的开放阅读框。ORF1编码其复制蛋白（Rep）,ORF2编码其衣壳蛋白（Cap）,含有免疫显性的抗原表位[l]。PCV2在世界范围内,不管家猪还是野猪中普遍流行,引起一系列与PCV2相关的疾病综合症,即圆环病毒相关病（PCVAD）。如仔猪断奶综合症（PMWS）、皮炎肾病综合症（PDNS）和繁殖障碍等。给养猪行业带来巨大的影响。预防该病毒感染的最有效方法就是疫苗免疫。基于PCV2给世界整个养猪行业所带来的损失,对该病毒进行研究迫在眉睫,对控制、预防和治疗PCVAD具有很大意义。为了解PCV2的致病机理及其分子生物学特性,对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定,将获得的全基因组进行克隆、测序,用DNAStar对克隆的序列与GenBank上获取的其它PCV2全基因组进行序列分析。分离到两株病毒,命名为HZ-09株和JIAOZ-12株。经间接免疫荧光试验可见感染病毒... 

【文章来源】：河南农业大学河南省

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
文献综述
    1 病原学
    2 流行病学
        2.1 地理分布
        2.2 易感物种
        2.3 PCV2感染途径
        2.4 排放途径
    3 发病机理
    4 临床症状及病变
        4.1 断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)
        4.2 猪皮炎和肾病综合征(PDNS)
        4.3 PCV2相关的肺炎
        4.4 PCV2相关的繁殖疾病
        4.5 PCV2相关的肠炎
        4.6 PCV2相关的神经疾病
        4.7 PCV2亚临床感染
    5 PCV2检测方法
        5.1 病毒的检测
            5.1.1 病毒抗原检测
            5.1.2 基因组检测
        5.2 病毒抗体检测
            5.2.1 间接免疫荧光试验(Immunofluorescence assay,IFA)
            5.2.2 免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)
            5.2.3 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
    6 目前商业PCV2疫苗
        6.1 试验感染模式中疫苗的效果
        6.2 接种方案
            6.2.1 疫苗在垂直传播上的功效
            6.2.2 母猪的接种
            6.2.3 生长猪的免疫
引言
试验一 PCV2河南株的分离鉴定及全基因组序列分析
    1 材料和方法
        1.1 试验材料
        1.2 引物设计
        1.3 病料处理
        1.4 病料PCV2的检测
        1.5 病毒的分离与培养
        1.6 PCV2的间接免疫荧光鉴定
        1.7 PCV2全基因组的PCR扩增
        1.8 PCV2全基因组序列的测定与分析
    2 结果与分析
        2.1 样品PCR检测结果
        2.2 PCV2的细胞培养结果
        2.3 荧光染色鉴定结果
        2.4 细胞毒中PCV2基因组扩增结果
        2.5 序列的测定及分析
    3 结论与讨论
试验二 PCV2河南分离株增殖条件的优化
    1 材料与方法
        1.1 病毒和细胞
        1.2 主要试剂
        1.3 IFA反应条件的选择
            1.3.1 PCV2抗血清的工作浓度
            1.3.2 兔抗猪IG-g-FITC的工作浓度
        1.4 PCV2增殖条件的优化
            1.4.1 D-氨基葡萄糖的最佳浓度
            1.4.2 最佳收毒时间的确定
        1.5 PCV2传代增殖
        1.6 TCID50测定
    2 结果与分析
        2.1 IFA反应条件的优化
            2.1.1 PCV2抗血清最佳稀释度
            2.1.2 二抗最佳稀释度
        2.2 PCV2增殖条件的优化
            2.2.1 D-氨基葡萄糖的最佳刺激浓度
            2.2.2 病毒培养最佳时间
        2.3 PCV2增殖情况
        2.4 病毒效价的测定
    3 结论与讨论
试验三 PCV2增殖敏感PK15细胞的克隆与筛选
    1 材料与方法
        1.1 PK15细胞
        1.2 PK15细胞克隆
        1.3 PCV2增值易感PK15克隆细胞筛选
        1.4 间接免疫荧光试验(IFA)
        1.5 克隆细胞PCV1的检测
        1.6 PK15细胞的传代、冻存与复苏
        1.7 病毒TCID50测定
        1.8 L8对PCV2增殖稳定性检测
    2 结果与分析
        2.1 细胞克隆与PCV2 IFA检测
        2.2 PCV1检测结果
        2.3 L8克隆PK15细胞培养PCV2毒株TCID50测定
        2.4 克隆细胞传代、冻存与复苏
        2.5 L8对PCV2增殖的稳定性
    3 结论与讨论
附录
全文总结
参考文献
abstract
攻读硕士期间发表的论文



本文编号：3379427