H5 2.3.4.4谱系A/B嵌合疫苗候选株的构建及初步评价
发布时间：2021-09-03 05:10
实验目的:利用B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统,以B型流感病毒为骨架,分别构建含有H5 2.3.4.4谱系H5N6亚型禽流感病毒HA基因的A/B嵌合流感病毒株及A/B嵌合流感病毒减毒株,作为H5亚型流感的疫苗候选株。对拯救的两种嵌合病毒进行鉴定,并初步评价其致病性以及免疫保护效力,为新型流感疫苗的研发及B型流感病毒包装机制的研究提供了新的思路。实验内容及方法:病毒的拯救与鉴定。对H5 2.3.4.4谱系HA进行改造,利用反向遗传技术拯救A/B型嵌合流感病毒株和A/B型嵌合流感减毒株,对拯救成功的两种病毒株进行形态学和序列鉴定。嵌合毒株BALB/c小鼠的致病性实验。将嵌合毒株分别以105EID50/50μl,104EID50/50μl等不同剂量,嵌合减毒株分别以104EID50/50μl,103EID50/50μl,102EID50/5...
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HA0前体结构，箭头指示切割位点；（b）HA0前体裂解为HA1和HA2示意图；（c）不同流感病毒HA切割位点处氨基酸序列比对[26]
图 3 A 型流感病毒及其核糖核蛋白复合体（vRNP）结构示意图[30] Schematic diagram of influenza A virus and its ribonucleoprotein complex (vRNP)[30为单股负链的 RNA 病毒，流感病毒的复制需要依赖 RNA 聚合酶。由 vR 聚合酶的作用下首先要转录出互补的正链 RNA 后，以正链 RNA 为模板 RNA 以及病毒蛋白，这为从克隆的 cDNA 产生具有传染性的流感病毒带。因为反义的 RNA 病毒的基因组 vRNA 不能作为病毒蛋白质合成的直接是病毒 vRNA 需要在被病毒核蛋白（NP）包裹后，通过 RNA 聚合酶复成 mRNA。因此，流感病毒最小的复制单元应该是由 NP，聚合酶以及病形成的 vRNP[31]。1990 年，Palese 及他的同事[32]开创了依赖辅助病毒的病毒反向遗传系统，在这个方法中，流感病毒的核糖核蛋白复合物（R vRNA，纯化的聚合酶以及 NP 蛋白一起人工合成产生的，然后用合成染真核细胞，随后用辅助病毒感染转染细胞，以产生拯救病毒。1994 年nn 等人开发了可以在转染细胞内合成拯救病毒 vRNA 的 RNA 聚合酶Ⅰ毒的质粒克隆入载体，两端连接 RNA 聚合酶Ⅰ的启动子和终止子，将重染真核细胞，随后用辅助病毒感染转染细胞后获得拯救病毒。但是这两
军事科学院硕士学位论文聚合酶Ⅰ启动子控制，生成病毒 RNA，将拯救病毒 PB2，PB1，PA，NP片段由聚合酶Ⅱ启动子控制，表达病毒聚合酶及 NP 蛋白。002 年 Hoffmann 等人以及 David Jackson 等人分别提出了 B 型流感病毒反统的构建。David Jackson 等人[34]运用反向遗传系统拯救重组 A 型流感病建立了 B 型流感病毒反向遗传系统。他们利用 pPRG 作为载体，在 B 型基因片段的 5’末端拼接上人 RNA 聚合酶启动子Ⅰ，在 3’末端拼接上丁型的核酶终止子。他们还构建了表达流感病毒RNA聚合酶3种蛋白PB2，PBP 的辅助质粒，将这些质粒共转染 293T 细胞获得 B 型流感病毒。Hoffma5]将 pHW2000 载体改造为 pAD3000 载体，在将 B 型流感病毒基因片段两 RNA 聚合酶Ⅰ和 RNA 聚合酶Ⅱ转录单元，将重组质粒转染 COS7 细胞流感病毒。如图 4 所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立[J]. 孙伟洋,于志君,李雪,陈强,高晓龙,国娇,张坤,李元果,王铁成,杨松涛,黄耕,赵永坤,高玉伟,夏咸柱. 中国实验动物学报. 2015(01)
[2]H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立[J]. 李泽君,焦培荣,于康震,陈化兰. 中国农业科学. 2005(08)
[3]流感减毒活疫苗的历史回顾[J]. 刘启良. 国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册. 2002(01)
本文编号：3380475
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HA0前体结构，箭头指示切割位点；（b）HA0前体裂解为HA1和HA2示意图；（c）不同流感病毒HA切割位点处氨基酸序列比对[26]
图 3 A 型流感病毒及其核糖核蛋白复合体（vRNP）结构示意图[30] Schematic diagram of influenza A virus and its ribonucleoprotein complex (vRNP)[30为单股负链的 RNA 病毒，流感病毒的复制需要依赖 RNA 聚合酶。由 vR 聚合酶的作用下首先要转录出互补的正链 RNA 后，以正链 RNA 为模板 RNA 以及病毒蛋白，这为从克隆的 cDNA 产生具有传染性的流感病毒带。因为反义的 RNA 病毒的基因组 vRNA 不能作为病毒蛋白质合成的直接是病毒 vRNA 需要在被病毒核蛋白（NP）包裹后，通过 RNA 聚合酶复成 mRNA。因此，流感病毒最小的复制单元应该是由 NP，聚合酶以及病形成的 vRNP[31]。1990 年，Palese 及他的同事[32]开创了依赖辅助病毒的病毒反向遗传系统，在这个方法中，流感病毒的核糖核蛋白复合物（R vRNA，纯化的聚合酶以及 NP 蛋白一起人工合成产生的，然后用合成染真核细胞，随后用辅助病毒感染转染细胞，以产生拯救病毒。1994 年nn 等人开发了可以在转染细胞内合成拯救病毒 vRNA 的 RNA 聚合酶Ⅰ毒的质粒克隆入载体，两端连接 RNA 聚合酶Ⅰ的启动子和终止子，将重染真核细胞，随后用辅助病毒感染转染细胞后获得拯救病毒。但是这两
军事科学院硕士学位论文聚合酶Ⅰ启动子控制，生成病毒 RNA，将拯救病毒 PB2，PB1，PA，NP片段由聚合酶Ⅱ启动子控制，表达病毒聚合酶及 NP 蛋白。002 年 Hoffmann 等人以及 David Jackson 等人分别提出了 B 型流感病毒反统的构建。David Jackson 等人[34]运用反向遗传系统拯救重组 A 型流感病建立了 B 型流感病毒反向遗传系统。他们利用 pPRG 作为载体，在 B 型基因片段的 5’末端拼接上人 RNA 聚合酶启动子Ⅰ，在 3’末端拼接上丁型的核酶终止子。他们还构建了表达流感病毒RNA聚合酶3种蛋白PB2，PBP 的辅助质粒，将这些质粒共转染 293T 细胞获得 B 型流感病毒。Hoffma5]将 pHW2000 载体改造为 pAD3000 载体，在将 B 型流感病毒基因片段两 RNA 聚合酶Ⅰ和 RNA 聚合酶Ⅱ转录单元，将重组质粒转染 COS7 细胞流感病毒。如图 4 所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立[J]. 孙伟洋,于志君,李雪,陈强,高晓龙,国娇,张坤,李元果,王铁成,杨松涛,黄耕,赵永坤,高玉伟,夏咸柱. 中国实验动物学报. 2015(01)
[2]H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立[J]. 李泽君,焦培荣,于康震,陈化兰. 中国农业科学. 2005(08)
[3]流感减毒活疫苗的历史回顾[J]. 刘启良. 国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册. 2002(01)
本文编号：3380475
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