多杀性巴氏杆菌lon缺失突变株的构建及生物学特性的研究

发布时间：2021-09-03 04:17

　　多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, P.multocida）属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属,是革兰氏阴性菌,能够引起动物的急性和慢性感染,发病率和死亡率很高,临床特征表现为肺炎、萎缩性鼻炎、皮肤坏死、蜂窝组织炎、脓肿、脑膜炎和出血性败血症,引起的主要动物疾病包括禽霍乱、牛出血性败血症、兔出血性败血症、猪萎缩性鼻炎和猪肺疫。Lon是一种ATP依赖的蛋白酶,可降解异常蛋白和特异性调控其它调控蛋白,与细菌的致病性有关。从感染多杀性巴氏杆菌兔肝脏组织筛选鉴定lon基因,验证其酶活性,构建其突变株,对揭示多杀性巴氏杆菌的致病机制及调节机制有重要意义。本研究利用PCR扩增多杀性巴氏杆菌C51-17株lon基因,将其克隆到质粒pET30a（+）中, pET30a-Lon转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经0.1mmoI/L IPTG诱导表达,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化Lon蛋白。SDS-PAGE结果表明,重组Lon蛋白分子量大小97ku,主要以可溶性蛋白形式表达；western blot检测结果表明,重组蛋白能够被P.multocida阳性血清... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 多杀性巴氏杆菌研究概况
        1.1.1 流行现状
        1.1.2 传播途径
        1.1.3 危害
    1.2 病原学
        1.2.1 分类、生长特性及理化性质
        1.2.2 抗原与血清型
    1.3 主要毒力因子的研究进展
        1.3.1 脂多糖
        1.3.2 荚膜
        1.3.3 多杀性巴氏杆菌毒素
        1.3.4 外膜蛋白
        1.3.5 调控蛋白
    1.4 临床症状
    1.5 诊断方法
        1.5.1 病原学诊断
        1.5.2 血清学诊断
        1.5.3 分子生物学诊断
    1.6 多杀性巴氏杆菌的防治
    1.7 疫苗的研究进展
        1.7.1 灭活菌苗
        1.7.2 亚单位疫苗
        1.7.3 弱毒疫苗
    1.8 研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验动物、细胞
        2.1.2 菌株和质粒
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 主要试剂的配制
    2.2 方法
        2.2.1 C51-17菌株基因组的提取
        2.2.2 引物合成与设计
        2.2.3 多杀性巴氏杆菌Lon蛋白酶的ATPase活性检测
        2.2.4 自杀性质粒的构建
        2.2.5 多杀性巴氏杆菌C51-17电转化感受态细胞的制备
        2.2.6 自杀性质粒的电转化
        2.2.7 突变株的筛选及鉴定
        2.2.8 突变株的生物学特性
        2.2.9 Δlon突变株抗逆性实验
        2.2.10 突变株的粘附特性实验
        2.2.11 突变株的致病性试验
3 结果与分析
    3.1 Lon蛋白酶的ATPase活性检测
        3.1.1 重组表达质粒pET30a-Lon的鉴定结果
        3.1.2 重组蛋白的表达、纯化和western blot检测结果
        3.1.3 ELISA检测Lon蛋白多克隆抗体的效价结果
        3.1.4 Lon蛋白酶ATPase活性检测
    3.2 lon上下游同源臂的PCR扩增结果
    3.3 自杀性质粒的酶切鉴定结果
    3.4 自杀性质粒PBC-Δlon的电转化及Δlon突变株的筛选结果
        3.4.1 Δlon突变株的PCR鉴定结果
        3.4.2 Δlon突变株的生物学特性测定结果
        3.4.3 突变株抗逆特性结果分析
        3.4.4 Δlon突变株的粘附试验结果
        3.4.5 Δlon对小鼠的致病性结果
4 讨论
    4.1 Lon蛋白酶ATPase检测
    4.2 细菌突变株构建技术
    4.3 细菌的生长特性及对细胞的粘附
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
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[3]禽霍乱蜂胶灭活疫苗的制苗及电镜观察[J]. 于智慧,沈志强.  中兽医医药杂志. 2006(03)
[4]猪多杀性巴氏杆菌对HeLa细胞附着能力的研究[J]. 恩特马克·布拉提白,晁群芳,吾鲁木汗·那扎尔别克,钟哲,张富春.  中国兽医杂志. 2005(04)
[5]禽巴氏杆菌B26-T1200弱毒冻干苗的研究 Ⅰ.禽巴氏杆菌B26- T1200弱毒菌株的选育[J]. 宁振华,左婉顺,谢芝勋,黄媛,刘加波,庞耀珊,郑永娇.  中国兽医学报. 1998(03)
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[7]禽霍乱克隆89弱毒菌苗免疫原性及免疫持续期试验[J]. 王文科,李金贡,郑成江.  华北农学报. 1995(01)
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[10]禽源多杀性巴氏杆菌（A:1）荚膜保护性抗原提纯及单克隆抗体细胞系建立[J]. 步恒富,马从林,刘■,邓定华.  兽医大学学报. 1990(03)



本文编号：3380388