猪萨佩罗病毒real-time RT-PCR检测方法的建立

发布时间：2017-05-01 05:01

  本文关键词：猪萨佩罗病毒real-time RT-PCR检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪萨佩罗病毒感染(porcine sapelovirus infection)是由猪萨佩罗病毒所引起的,临床表现为猪脑脊髓灰质炎、肺炎、繁殖障碍、腹泻等多系统综合征及无明显症状的一种危害养猪业的重要传染病。本研究建立了一种检测PSV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,利用该方法对PSV感染组织特异性进行初步研究,并对四川省部分地区PSV感染情况进行调查。在此基础上,通过克隆分析1B基因,对PSV遗传变异进行分析,为进一步开展相关研究奠定了基础。本研究根据GenBank中PSV的3D基因的保守序列设计并合成一对针对PSV的特异性引物,经反应条件的优化,建立了基于SYBR Green Ⅱ检测PSV的实时荧光定量RT-PCR方法。荧光定量RT-PCR反应所获的标准曲线显示,反应中模板DNA的量与荧光定量RT-PCR的CT值呈良好的线性关系,直线方程为y=-3.307 x+38.706,相关系数R2达到0.999。所建方法特异性强,能很好地将PSV与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪嵴病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及A群猪轮状病毒区分开,扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰；敏感性高,检测下限为1.44×102copies/μL,比普通PCR敏感100倍；重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于1.5%。应用该方法对8头自然感染PSV猪的各组织样品进行检测,结果发现,PSV在猪体内分布广泛,而不同组织病毒载量差异较大,最高的为肠道和粪便。对采集自四川部分地区规模化猪场2014-2015年间428份临床腹泻病料进行检测,结果表明,各地区均存在PSV感染,PSV总阳性率为26.6%(114/428),对各年龄段猪PSV感染率进行统计发现,5-9周龄猪感染率最高,达到37.4%(55/147)。以上结果表明,本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性较强、灵敏度高、重复性好,可用于该病毒的临床检测、定量分析及流行病学调查。为了解PSV的感染情况及毒株的变异情况,本研究设计一对扩增猪萨佩罗病毒1B全基因的特异性引物,利用RT-PCR扩增不同地区猪萨佩罗病毒1B全基因,通过分子克隆,测序得到14个猪萨佩罗病毒1B基因序列,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列相似性分别为90.6-100%和97.1-100%。遗传进化分析显示,本研究获得的四川株与已知中国株分属于一个大的分支,说明我国猪萨佩罗病毒1B基因序列较为保守,没有发生大的基因变异。所有中国分离株与韩国株、德国株、英国株处在不同分支,推测认为我国PSV的流行毒株可能为固有毒株而非引入的新疫情。
【关键词】：猪萨佩罗病毒 荧光定量RT-PCR 1B基因 遗传进化分析
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 常用缩略词表8-12
• 文献综述12-21
• 1 病原学12-17
• 1.1 猪萨佩罗病毒的分类12-13
• 1.2 猪萨佩罗病毒粒子的结构特征13
• 1.3 猪萨佩罗病毒的基因组结构特征及复制13-14
• 1.4 病毒的理化特性和培养特性14-15
• 1.5 猪萨佩罗病毒的结构蛋白和非结构蛋白及其功能15-17
• 2 PSV感染的临诊症状及病理变化17-18
• 2.1 临诊症状17
• 2.2 病理变化17-18
• 3 PSV流行病学18-19
• 4 猪萨佩罗病毒的检测19-21
• 4.1 病毒的分离与鉴定19-20
• 4.2 分子生物学方法20
• 4.3 免疫学方法20-21
• 5 防制21
• 研究的目的和意义21-23
• 第一章 猪萨佩罗病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用23-45
• 1 试验材料23-25
• 1.1 毒株23-24
• 1.2 临床样品的收集24
• 1.3 主要试剂与仪器24
• 1.4 溶液配制24-25
• 2 试验方法25-33
• 2.1 荧光定量RT-PCR引物的设计及合成25
• 2.2 重组质粒标准品的制备25-31
• 2.3 实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立31-32
• 2.4 实时荧光定量RT-PCR检测方法的应用32-33
• 3 结果33-41
• 3.1 质粒标准品的鉴定33
• 3.2 重组质粒浓度的测定33-34
• 3.3 优化的Real-time RT-PCR检测条件34
• 3.4 Real-time RT-PCR标准曲线的制作34
• 3.5 溶解曲线与特异性试验结果34-35
• 3.6 敏感性试验结果35-36
• 3.7 重复性试验结果36-37
• 3.8 实时荧光定量RT-PCR与常规PCR比较结果37-39
• 3.9 PSV感染组织特异性研究结果39
• 3.10 PSV感染情况调查39-41
• 4 讨论41-44
• 4.1 PSV Real-time RT-PCR检测方法的建立41-42
• 4.2 PSV感染组织特异性的初步研究42-43
• 4.3 腹泻猪群中PSV感染情况调查43-44
• 5 小结44-45
• 第二章 四川省2014-2015年PSV 1B基因遗传进化分析45-56
• 1 试验材料45-46
• 1.1 PSV阳性样品45
• 1.2 主要试剂及仪器45-46
• 1.3 分析软件46
• 2 试验方法46-48
• 2.1 引物设计46
• 2.3 1B基因的扩增,克隆及测序46-47
• 2.4 遗传进化分析47-48
• 3 结果48-53
• 3.3 PSV 1B全基因扩增48-49
• 3.4 猪萨罗病毒1B基因测序结果49
• 3.5 1B基因核苷酸序列及推导的氨基酸同源性分析49-50
• 3.6 1B基因遗传进化树的建立50-51
• 3.7 基因突变位点分析51-53
• 4 讨论53-55
• 5 小结55-56
• 全文结论56-57
• 参考文献57-63
• 致谢63

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本文编号：338238