基于牛布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22和OMP28三种重组蛋白的ELISA检测方法研究

发布时间：2017-04-29 20:10

  本文关键词：基于牛布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22和OMP28三种重组蛋白的ELISA检测方法研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：布鲁菌病(Brucellosis)作为一种在世界范围内危害严重的人畜共患病,具有重要的兽医公共卫生意义。为建立一种牛布鲁菌病快速可靠的血清学检测方法,本论文在对其三种外膜蛋白原核表达的基础上进行了基于重组蛋白混合抗原的酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)研究,具体如下：根据GenBank中登录的编码牛布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的基因序列,以布鲁菌A544株基因为模板,分别设计了3对特异性引物,利用PCR技术扩增目的基因片段。将目的基因分别克隆到pCold-TF原核表达载体系统中,经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定正确后进行IPTG诱导重组蛋白的表达、重组蛋白的SDS-PAGE分析与Western blot鉴定,并利用亲和层析技术对重组蛋白进行纯化,结果成功扩增出534 bp、639 bp和753bp的编码牛布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22、 OMP28的基因序列,并克隆到pCold-TF原核表达载体构建了3种蛋白基因的重组表达质粒pCold-TF-OMP19、pCold-TF-OMP22和pCold-TF-OMP28。诱导表达的3种重组蛋白分别为69kD、74 kD和80 kD,均为可溶性蛋白,Western blot显示均有良好反应原性。利用亲和层析技术对三种重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的蛋白。将三种重组蛋白按浓度比,等比例混合作为包被抗原,经过优化包被条件、封闭条件、反应温度和时间等初步建立了牛布鲁菌感染抗体检测的间接酶联免疫吸附方法(indirect ELISA, iELISA),并进行了实验室保存的300份临床样品检测应用,同时进行虎红平板凝集实验(RBPT),同类进口商品化试剂(IDEXX)的平行检测。结果显示建立的iELISA方法,最佳的混合抗原浓度为(1:1:1)μg/ml,最适封闭液为10%马血清,最适一抗稀释度为1：200,二抗稀释度为1：20000。该方法特异性良好,不与小肠结肠炎耶尔森菌诊断血清和大肠杆菌诊断血清发生交叉反应。300份临床血清样品检测结果显示虎红平板凝集试验(RBPT)检测62份为阳性,238份为阴性;以RBPT检测结果为标准,IDEXX试剂盒检测62份阳性血清中60份为阳性(假阴性2份),敏感率为96.78%(60/62)： 238份阴性血清中236份为阴性(假阳性2份),特异率为99.16%(236/238),总符合率为98.67%(296/300)。混合抗原rOMPs-ELISA法检测结果为,62份阳性血清中58份为阳性(假阴性4份),敏感率为93.5%(58/62);238份阴性血清中230份为阴性(假阳性8份),特异率为96.64%(230/238),总符合率为96%(288/300),为下一步布鲁菌抗体检测间接ELISA方法的商品化和应用奠定了基础。
【关键词】：牛布鲁菌 重组外膜蛋白 混合抗原 间接酶联免疫吸附试验
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 文献综述13-21
• 第一章 布鲁菌病及其检测技术13-21
• 1.1 布鲁菌病病原学13-14
• 1.2 布鲁菌病流行病学14-15
• 1.3 布鲁菌病检测方法研究进展15-18
• 1.3.1 病原学检测方法15-16
• 1.3.2 血清学检测方法16-17
• 1.3.2.1 全乳环状实验(MRT)16
• 1.3.2.2 试管凝集实验(SAT)16
• 1.3.2.3 虎红平板凝集实验(RBPT)16
• 1.3.2.4 补体结合实验(CFT)16
• 1.3.2.5 酶联免疫吸附实验(ELISA)16-17
• 1.3.2.6 荧光偏振试验(FPA)17
• 1.3.2.7 胶体金免疫层析法(GICA)17
• 1.3.3 分子生物学检测方法17-18
• 1.3.3.1 PCR检测法17-18
• 1.3.3.2 荧光定量PCR检测法18
• 1.3.3.3 环介导等温扩增技术(LAMP)18
• 1.4 布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28研究进展18-19
• 1.5 本研究目的意义19-21
• 试验研究21-51
• 第二章 布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的原核表达21-37
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌种和载体21
• 2.1.2 主要试剂及相关溶液21-22
• 2.1.3 主要使用仪器22-23
• 2.2 方法23-31
• 2.2.1 引物的设计与合成23
• 2.2.2 OMP19、OMP22、OMP28基因的扩增23-24
• 2.2.3 目的基因片段的回收24
• 2.2.4 原核表达载体pCold-TF的抽提24-25
• 2.2.5 原核载体与目的基因的双酶切25-26
• 2.2.6 原核表达载体与目的基因的连接与克隆26-27
• 2.2.7 重组质粒的阳性鉴定27-28
• 2.2.7.1 重组质粒的PCR鉴定27
• 2.2.7.2 重组质粒的双酶切鉴定27-28
• 2.2.8 重组蛋白的诱导表达28
• 2.2.9 重组蛋白的SDS-PAGE分析28-29
• 2.2.10 重组表达蛋白的反应原性分析29
• 2.2.11 OMP19、OMP22、OMP28重组蛋白的纯化29-30
• 2.2.12 测定纯化蛋白的浓度30-31
• 2.3 结果与分析31-35
• 2.3.1 OMP19、OMP22、OMP28重组表达载体的构建31-32
• 2.3.2 重组表达质粒的双酶切鉴定结果32-33
• 2.3.3 重组质粒的序列测定33
• 2.3.4 重组蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析33-35
• 2.4 讨论35-37
• 第三章 基于布鲁菌OMP19、OMP22和OMP28三种重组蛋白的iELISA方法研究37-51
• 3.1 材料37
• 3.1.1 血清、二抗37
• 3.1.2 主要试剂及相关溶液37
• 3.2 方法37-40
• 3.2.1 选择最适的混合抗原包被浓度和酶标二抗稀释度37-38
• 3.2.2 选择最适的一抗稀释度38
• 3.2.3 选择最适的包被条件38
• 3.2.4 选择最适的封闭液38
• 3.2.5 选择封闭时间38
• 3.2.6 选择最适的一抗反应时间38
• 3.2.7 选择酶标最适的二抗反应时间38-39
• 3.2.8 选择最适的显色液和显色时间39
• 3.2.9 选择最适的终止条件39
• 3.2.10 确定临界值(cut off value)39
• 3.2.11 特异性试验39
• 3.2.12 灵敏度试验39
• 3.2.13 重复性试验39
• 3.2.14 样品检测与评价39-40
• 3.2.14.1 iELISA检测40
• 3.2.14.2 RBPT检测40
• 3.2.14.3 IDEXX试剂盒检测40
• 3.2.14.4 数据比较40
• 3.3 结果与分析40-48
• 3.3.1 最适抗原包被浓度和酶标二抗最适稀释度的确定40-41
• 3.3.2 最适一抗稀释度的选择结果41
• 3.3.3 最适包被条件的选择结果41-42
• 3.3.4 最适封闭液的选择结果42-43
• 3.3.5 最适封闭时间的选择结果43
• 3.3.6 最适一抗反应时间的选择结果43-44
• 3.3.7 最适酶标二抗反应时间的选择结果44
• 3.3.8 最适显色液和显色时间的选择结果44-45
• 3.3.9 最适终止条件的选择结果45-46
• 3.3.10 确定临界值(cut off value)46
• 3.3.11 特异性试验结果46
• 3.3.12 灵敏性试验结果46-47
• 3.3.13 重复性试验结果47
• 3.3.14 评价试验结果47-48
• 3.4 讨论48-51
• 结论部分51-52
• 第四章 试验结论51-52
• 参考文献52-57
• 致谢57

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 许邹亮;南文龙;陈义平;;分子生物学技术在布鲁菌种型鉴定上的应用[J];动物医学进展;2012年01期

2 杨艳玲;唐婕;白光彦;盛雪玲;王成福;王兴龙;;羊布鲁菌膜蛋白的提取及血清抗体间接ELISA检测方法的建立[J];中国生物制品学杂志;2010年04期

3 吴小艳;王希良;;布鲁菌与巨噬细胞相互作用的研究进展[J];微生物学免疫学进展;2008年01期

4 李秀梅;郭恋;梁智选;李颖;郭立力;石瑜;朱雅宁;王红军;;布鲁菌环介导等温扩增检测试剂盒的研制[J];动物医学进展;2014年07期

5 骆利敏;崔步云;赵鸿雁;芮勇宇;李明;;脉冲场电泳分析布鲁菌标准菌株[J];检验医学;2006年05期

6 邓丽芳;黄亚宁;罗雯;;布鲁菌病疫苗研制进展[J];陕西农业科学;2012年02期

7 赵忠鹏;王希良;;布鲁菌毒力因子研究进展[J];微生物学免疫学进展;2007年01期

8 徐杰;于爽;付思美;钟志军;王玉飞;曲R

本文编号：335524