猪源产肠毒素大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立及初步应用

发布时间：2021-09-04 22:28

　　为建立一种可同时快速准确检测5种菌毛类型的产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的多重PCR方法,本研究首先通过大肠杆菌特异性基因uidA的PCR方法鉴定大肠杆菌;选取国内外流行的携带K88、K99、F18ab、F18ac和F41菌毛基因的ETEC菌株,根据这5种菌毛基因的保守序列设计5对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了能同时检测上述5种菌毛ETEC的多重PCR方法。uidA基因的PCR结果显示,除了大肠杆菌有特异性扩增外,其他细菌均不能扩增,可以用于大肠杆菌的鉴定。菌毛多重PCR优化后的反应条件为:各混合菌毛基因引物终浓度为3.2μmol/L,各大肠杆菌混合DNA模板浓度为2.5×107拷贝/μL,退火温度为58℃;特异性试验结果显示,该多重PCR方法能够特异性扩增5种ETEC的菌毛基因,而猪源沙门氏菌、猪源链球菌和大肠杆菌DH5α未见扩增,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对携带5种菌毛的大肠杆菌基因组DNA的最低检测量均为2.5×104拷贝/μL,敏感性较高。采用uidA基因的PCR方法检测了河北省腹泻致死仔猪脏器分离的101株细菌,结果均为大肠杆菌。采用该多重PCR方法和单一P... 

【文章来源】：中国预防兽医学报. 2020,42(11)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

大肠杆菌uid A基因的PCR扩增结果

使用表1中的引物分别对5种携带不同菌毛基因的标准ETEC基因组DNA进行单一PCR扩增。结果显示，5种标准菌株基因组DNA均扩增出了目的条带，且均与预期相符（菌毛基因K88、K99、F18ab、F18ac和F41产物长度分别为343 bp、157 bp、282 bp、494 bp和580 bp）（图2）。表明，各引物均能有效扩增各大肠杆菌菌毛基因。2.3 多重PCR反应条件优化结果

分别以各标准ETEC混合或者单独基因组DNA为模板，利用优化的多重PCR方法进行扩增。结果显示，多重PCR可从携带K88、K99、F18ab、F18ac和F41菌毛的大肠杆菌混合或者单独基因组DNA扩增出相应目的条带，但大肠杆菌DH5α、猪源霍乱沙门氏菌和猪源链球菌基因组DNA无扩增（图4），表明该方法特异性较强。图4 多重PCR的特异性试验结果

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3384121