基于鸭疫里黙氏杆菌表面抗原D15的乳胶凝集试验方法建立及其单克隆抗体的制备
发布时间：2021-09-06 08:42
目前,还未见到有关鸭疫里黙氏杆菌（RA）表面抗原D15截短蛋白的深入研究报道。本试验通过对本实验室在NCBI GenBank注册的Riemerella anatipestifer D15基因（登录号为CP003787）进行了生物信息学分析,对D15基因N端的主要抗原域进行了克隆和原核表达、重组蛋白纯化和多克隆抗体制备、检测鸭疫里黙氏杆菌抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立、RAD15截短蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定,结果如下：1.D15基因的生物信息学分析通过对D15基因及其编码蛋白的结构、抗原性、功能位点以及稀有密码子等进行了全面的生物信息学分析,结果显示RA D15基因包含2个保守结构域,与多种黄杆菌属同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性。其编码产物含有信号肽、1个跨膜区,可以定位于细胞外膜,抗原表位较多且在N端相对较多,不含有多个连续的稀有密码子。2.D15 N端基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备在上述分析基础上克隆了该基因并利用原核表达系统pET-28a（+）,表达了部分ORF编码产物（完整ORF编码产物不表达）,经SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小约为34 k...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩写词汇及其含义说明
第一部分 引言
一、Omp85蛋白家族的研究进展
1. Omp85蛋白家族的广泛性
2. Omp85蛋白家族的结构与功能
2.1 Omp85蛋白家族的结构
2.2 Omp85蛋白家族的功能
2.2.1 参与其他β筒型蛋白的装配,整合相关蛋白质至外膜蛋白
2.2.1.1 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-细菌外膜蛋白转运机制
2.2.1.2 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-线粒体外膜蛋白转运机制
2.2.1.3 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-叶绿体外膜蛋白转运机制
2.2.2 影响其他β筒形蛋白的成熟与定位,对细胞的生长、分化和存活具有重要作用
2.2.3 Omp85蛋白家族的免疫原性
3. 展望
二、选题目的和意义
第二部分 试验研究
1 材料
1.1 基因文库和D15氨基酸参考序列
1.2 实验动物和细胞株
1.3 载体与蛋白
1.4 菌株与血清
1.5 仪器与器材
1.6 主要试剂及配制
1.6.1 常规分子生物学用试剂
1.6.2 分析纯化学试剂
1.6.3 常用试剂的配制
1.6.4 细胞培养试剂
1.6.5 ELISA试验试剂
2 方法
2.1 RA D15基因的生物信息学分析
2.1.1 RA D15蛋白质的组成及其功能预测
2.1.2 RA D15蛋白质的抗原性分析
2.1.3 RA D15核苷酸序列的密码子偏爱性分析
2.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多抗制备
2.2.1 RA D15截短基因的扩增
2.2.1.1 RA D15截短基因引物的设计
2.2.1.2 RA CH-1株基因组的提取
2.2.1.3 RA D15截短基因的PCR扩增
2.2.2 PCR产物的T克隆与鉴定
2.2.2.1 PCR产物的T克隆
2.2.2.2 DH5a感受态细胞的制备
2.2.2.3 转化感受态细胞
2.2.2.4 T克隆鉴定
2.2.3 构建RA tD15基因的原核表达载体
2.2.3.1 重组表达载体的构建与鉴定
2.2.3.2 目的基因的诱导表达及鉴定
2.2.4 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
2.2.4.1 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体的制备
2.2.4.2 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体效价的测定
2.2.4.3 兔抗RA tD15重组蛋白IgG与RA的凝集实验
2.2.5 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的纯化和鉴定
2.2.5.1 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的粗提
2.2.5.2 阴离子交换层析法纯化兔抗重组tD15蛋白IgG
2.2.5.3 兔抗重组tD15蛋白IgG纯度鉴定
2.3 检测RA的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立
2.3.1 tD15蛋白致敏乳胶试剂的制备
2.3.2 RA tD15蛋白致敏乳胶最佳条件的筛选
2.3.2.1 最佳羧化乳胶浓度的选择
2.3.2.2 最佳重组蛋白偶联浓度的选择
2.3.2.3 最佳封闭液浓度的选择
2.3.2.4 最佳偶联时间的选择
2.3.2.5 最佳的致敏缓冲液pH值的选择
2.3.2.6 偶联效率的测定
2.3.3 操作步骤及结果判定
2.3.4 致敏乳胶质量鉴定
2.3.4.1 自凝性
2.3.4.2 特异性
2.3.4.3 重复性
2.3.4.4 敏感性
2.3.4.5 对比试验
2.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
2.4.1 免疫原的制备
2.4.2 抗RA tD15单克隆抗体的制备
2.4.2.1 BALB/c小鼠的免疫
2.4.2.2 小鼠骨髓瘤细胞的准备
2.4.2.3 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选
2.4.2.4 杂交瘤细胞株的培养与传代.复苏与冻存
2.4.2.5 腹水单抗的制备与纯化
2.4.3 McAb特性鉴定
2.4.3.1 稳定性
2.4.3.2 单抗亚类测定
2.4.3.3 特异性
2.4.3.4 效价测定
2.4.4 单抗亲和常数的测定
2.4.5 单抗抗原表位的初步鉴定
3 结果
3.1 RA D15基因的生物信息学分析
3.1.1 RA D15基因序列相似性搜索结果
3.1.2 蛋白质的组成及其功能预测
3.1.2.1 氨基酸理化特性的分析
3.1.2.2 信号肽切割位点预测结果
3.1.2.3 跨膜区预测结果
3.1.2.4 分析蛋白功能位点预测结果
3.1.2.5 二级结构分析结果
3.1.2.6 亚细胞定位分析结果
3.1.3 蛋白质的抗原性分析
3.1.3.1 B细胞抗原表位预测
3.1.3.2 T细胞抗原表位预测
3.1.4 RA D15基因密码子偏爱性分析
3.1.4.1 氨基酸组成和密码子使用频率偏爱分析
3.1.4.2 RA D15基因稀有密码子的分析
3.1.4.3 RA D15基因的密码子与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性比较
3.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备
3.2.1 RA D15 N端基因的扩增及其T克隆鉴定
3.2.2 重组表达质粒pET28a-tD15的鉴定
3.2.3 pET-28a(+)-tD15融合表达质粒的诱导与鉴定
3.2.4 兔抗RA tD15重组蛋白IgG特性测定
3.2.4.1 兔抗RA tD15重组蛋白IgG效价的测定
3.2.4.2 兔抗RA tD15重组蛋白IgG与IR A的凝集实验
3.2.4.3 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的纯化
3.3 检测RA抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立
3.3.1 RA tD15蛋白致敏乳胶最佳条件的筛选
3.3.1.1 最佳羧化乳胶浓度的选择
3.3.1.2 最佳重组蛋白偶联浓度的选择
3.3.1.3 最佳封闭液浓度的选择
3.3.1.4 最佳偶联时间的选择
3.3.2 致敏乳胶质量鉴定
3.3.2.1 自凝性
3.3.2.2 特异性
3.3.2.3 重复性
3.3.2.4 敏感性
3.3.2.5 对比试验
3.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
3.4.1 免疫原的制备
3.4.2 抗RA tD15 McAb的制备
3.4.2.1 杂交瘤细胞株的建立与筛选
3.4.2.2 腹水单抗的制备与纯化
3.4.3 McAb特性鉴定
3.4.3.1 稳定性
3.4.3.2 抗体亚类测定
3.4.3.3 特异性
3.4.3.4 细胞培养上清及腹水效价的测定
3.4.4 单抗亲和常数的测定
3.4.5 单抗抗原表位的初步鉴定
4 讨论
4.1 RA D15基因的生物信息学分析
4.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备
4.3 检测RA抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立
4.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
第三部分 结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 朱虹,陈珵,凌峰,邵晨,余敏,邵世和. 江苏大学学报(医学版). 2013(03)
[2]禽网状内皮增生症病毒gp90蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 石星明,张晶,赵妍,王玫,魏秀英,胡顺磊,全炎铭,闫帅,崔红玉,王云峰. 畜牧兽医学报. 2011(09)
[3]鸭疫里默氏菌环介导等温扩增检测方法的建立[J]. 陈红梅,程龙飞,施少华,傅光华,万春和,黄瑜,李宋钰. 中国农学通报. 2010(20)
[4]应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体[J]. 李永亮,田美娜,卢曾军,杨苏珍,刘在新. 中国生物工程杂志. 2008(11)
[5]鸭疫里默菌实验室诊断方法研究进展[J]. 蔡秀磊,韦强,鲍国连,霍翠梅,季权安,张先福. 动物医学进展. 2006(05)
[6]利用16S rDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌[J]. 曲丰发,蔡畅,郑献进,张大丙. 微生物学报. 2006(01)
[7]间接免疫组化法检测鸭疫里默氏杆菌感染和抗原定位[J]. 刘维平,程安春,汪铭书,陈孝跃,周毅,朱德康,刘菲,孟琼华,黄诚,宋涌. 中国兽医学报. 2005(04)
[8]Analysis of Synonymous Codon Usage Bias in Chlamydia[J]. Hui L(?) Wei-Ming ZHAO~* Yan ZHENG Hong WANG Mei QI Xiu-Ping YU Department of Medical Microbiology,School of Medicine,Shangdong University,Jinan 250012,China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(01)
[9]我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现和病原特性[J]. 程安春,汪铭书,陈孝跃,朱德康,黄城,刘菲,周毅,郭宇飞,刘兆宇,方鹏飞. 中国兽医学报. 2003(04)
[10]兔抗人ERA多克隆抗体的纯化[J]. 万亚坤,张俊杰,陈南春,陈苏民. 细胞与分子免疫学杂志. 2001(02)
硕士论文
[1]间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测四种血清型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究[D]. 方鹏飞.四川农业大学 2002
本文编号：3387141
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩写词汇及其含义说明
第一部分 引言
一、Omp85蛋白家族的研究进展
1. Omp85蛋白家族的广泛性
2. Omp85蛋白家族的结构与功能
2.1 Omp85蛋白家族的结构
2.2 Omp85蛋白家族的功能
2.2.1 参与其他β筒型蛋白的装配,整合相关蛋白质至外膜蛋白
2.2.1.1 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-细菌外膜蛋白转运机制
2.2.1.2 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-线粒体外膜蛋白转运机制
2.2.1.3 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-叶绿体外膜蛋白转运机制
2.2.2 影响其他β筒形蛋白的成熟与定位,对细胞的生长、分化和存活具有重要作用
2.2.3 Omp85蛋白家族的免疫原性
3. 展望
二、选题目的和意义
第二部分 试验研究
1 材料
1.1 基因文库和D15氨基酸参考序列
1.2 实验动物和细胞株
1.3 载体与蛋白
1.4 菌株与血清
1.5 仪器与器材
1.6 主要试剂及配制
1.6.1 常规分子生物学用试剂
1.6.2 分析纯化学试剂
1.6.3 常用试剂的配制
1.6.4 细胞培养试剂
1.6.5 ELISA试验试剂
2 方法
2.1 RA D15基因的生物信息学分析
2.1.1 RA D15蛋白质的组成及其功能预测
2.1.2 RA D15蛋白质的抗原性分析
2.1.3 RA D15核苷酸序列的密码子偏爱性分析
2.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多抗制备
2.2.1 RA D15截短基因的扩增
2.2.1.1 RA D15截短基因引物的设计
2.2.1.2 RA CH-1株基因组的提取
2.2.1.3 RA D15截短基因的PCR扩增
2.2.2 PCR产物的T克隆与鉴定
2.2.2.1 PCR产物的T克隆
2.2.2.2 DH5a感受态细胞的制备
2.2.2.3 转化感受态细胞
2.2.2.4 T克隆鉴定
2.2.3 构建RA tD15基因的原核表达载体
2.2.3.1 重组表达载体的构建与鉴定
2.2.3.2 目的基因的诱导表达及鉴定
2.2.4 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
2.2.4.1 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体的制备
2.2.4.2 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体效价的测定
2.2.4.3 兔抗RA tD15重组蛋白IgG与RA的凝集实验
2.2.5 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的纯化和鉴定
2.2.5.1 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的粗提
2.2.5.2 阴离子交换层析法纯化兔抗重组tD15蛋白IgG
2.2.5.3 兔抗重组tD15蛋白IgG纯度鉴定
2.3 检测RA的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立
2.3.1 tD15蛋白致敏乳胶试剂的制备
2.3.2 RA tD15蛋白致敏乳胶最佳条件的筛选
2.3.2.1 最佳羧化乳胶浓度的选择
2.3.2.2 最佳重组蛋白偶联浓度的选择
2.3.2.3 最佳封闭液浓度的选择
2.3.2.4 最佳偶联时间的选择
2.3.2.5 最佳的致敏缓冲液pH值的选择
2.3.2.6 偶联效率的测定
2.3.3 操作步骤及结果判定
2.3.4 致敏乳胶质量鉴定
2.3.4.1 自凝性
2.3.4.2 特异性
2.3.4.3 重复性
2.3.4.4 敏感性
2.3.4.5 对比试验
2.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
2.4.1 免疫原的制备
2.4.2 抗RA tD15单克隆抗体的制备
2.4.2.1 BALB/c小鼠的免疫
2.4.2.2 小鼠骨髓瘤细胞的准备
2.4.2.3 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选
2.4.2.4 杂交瘤细胞株的培养与传代.复苏与冻存
2.4.2.5 腹水单抗的制备与纯化
2.4.3 McAb特性鉴定
2.4.3.1 稳定性
2.4.3.2 单抗亚类测定
2.4.3.3 特异性
2.4.3.4 效价测定
2.4.4 单抗亲和常数的测定
2.4.5 单抗抗原表位的初步鉴定
3 结果
3.1 RA D15基因的生物信息学分析
3.1.1 RA D15基因序列相似性搜索结果
3.1.2 蛋白质的组成及其功能预测
3.1.2.1 氨基酸理化特性的分析
3.1.2.2 信号肽切割位点预测结果
3.1.2.3 跨膜区预测结果
3.1.2.4 分析蛋白功能位点预测结果
3.1.2.5 二级结构分析结果
3.1.2.6 亚细胞定位分析结果
3.1.3 蛋白质的抗原性分析
3.1.3.1 B细胞抗原表位预测
3.1.3.2 T细胞抗原表位预测
3.1.4 RA D15基因密码子偏爱性分析
3.1.4.1 氨基酸组成和密码子使用频率偏爱分析
3.1.4.2 RA D15基因稀有密码子的分析
3.1.4.3 RA D15基因的密码子与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性比较
3.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备
3.2.1 RA D15 N端基因的扩增及其T克隆鉴定
3.2.2 重组表达质粒pET28a-tD15的鉴定
3.2.3 pET-28a(+)-tD15融合表达质粒的诱导与鉴定
3.2.4 兔抗RA tD15重组蛋白IgG特性测定
3.2.4.1 兔抗RA tD15重组蛋白IgG效价的测定
3.2.4.2 兔抗RA tD15重组蛋白IgG与IR A的凝集实验
3.2.4.3 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的纯化
3.3 检测RA抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立
3.3.1 RA tD15蛋白致敏乳胶最佳条件的筛选
3.3.1.1 最佳羧化乳胶浓度的选择
3.3.1.2 最佳重组蛋白偶联浓度的选择
3.3.1.3 最佳封闭液浓度的选择
3.3.1.4 最佳偶联时间的选择
3.3.2 致敏乳胶质量鉴定
3.3.2.1 自凝性
3.3.2.2 特异性
3.3.2.3 重复性
3.3.2.4 敏感性
3.3.2.5 对比试验
3.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
3.4.1 免疫原的制备
3.4.2 抗RA tD15 McAb的制备
3.4.2.1 杂交瘤细胞株的建立与筛选
3.4.2.2 腹水单抗的制备与纯化
3.4.3 McAb特性鉴定
3.4.3.1 稳定性
3.4.3.2 抗体亚类测定
3.4.3.3 特异性
3.4.3.4 细胞培养上清及腹水效价的测定
3.4.4 单抗亲和常数的测定
3.4.5 单抗抗原表位的初步鉴定
4 讨论
4.1 RA D15基因的生物信息学分析
4.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备
4.3 检测RA抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立
4.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
第三部分 结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 朱虹,陈珵,凌峰,邵晨,余敏,邵世和. 江苏大学学报(医学版). 2013(03)
[2]禽网状内皮增生症病毒gp90蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 石星明,张晶,赵妍,王玫,魏秀英,胡顺磊,全炎铭,闫帅,崔红玉,王云峰. 畜牧兽医学报. 2011(09)
[3]鸭疫里默氏菌环介导等温扩增检测方法的建立[J]. 陈红梅,程龙飞,施少华,傅光华,万春和,黄瑜,李宋钰. 中国农学通报. 2010(20)
[4]应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体[J]. 李永亮,田美娜,卢曾军,杨苏珍,刘在新. 中国生物工程杂志. 2008(11)
[5]鸭疫里默菌实验室诊断方法研究进展[J]. 蔡秀磊,韦强,鲍国连,霍翠梅,季权安,张先福. 动物医学进展. 2006(05)
[6]利用16S rDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌[J]. 曲丰发,蔡畅,郑献进,张大丙. 微生物学报. 2006(01)
[7]间接免疫组化法检测鸭疫里默氏杆菌感染和抗原定位[J]. 刘维平,程安春,汪铭书,陈孝跃,周毅,朱德康,刘菲,孟琼华,黄诚,宋涌. 中国兽医学报. 2005(04)
[8]Analysis of Synonymous Codon Usage Bias in Chlamydia[J]. Hui L(?) Wei-Ming ZHAO~* Yan ZHENG Hong WANG Mei QI Xiu-Ping YU Department of Medical Microbiology,School of Medicine,Shangdong University,Jinan 250012,China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(01)
[9]我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现和病原特性[J]. 程安春,汪铭书,陈孝跃,朱德康,黄城,刘菲,周毅,郭宇飞,刘兆宇,方鹏飞. 中国兽医学报. 2003(04)
[10]兔抗人ERA多克隆抗体的纯化[J]. 万亚坤,张俊杰,陈南春,陈苏民. 细胞与分子免疫学杂志. 2001(02)
硕士论文
[1]间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测四种血清型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究[D]. 方鹏飞.四川农业大学 2002
本文编号：3387141
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