鹅胚成纤维细胞系的建立及鹅细小病毒细胞适应株的培育

发布时间：2021-09-09 08:53

　　鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）是小鹅瘟的病原,易感染4-20日龄各品系的雏鹅和雏番鸭,而对其他禽类和哺乳动物均没有感染性。该病具有传播速度快,发病率高和死亡率高的特点,临床表现为腹泻、精神萎靡、食欲减退和呼吸困难。主要传播方式主要是水平传播和垂直传播,水平传播是通过消化道传播,垂直传播是通过种蛋传染。该病没有显著的季节性,全年都有可能发生,但以冬、春季发生为主。由于该病传播快、病程短、病死率高,是严重危害养鹅业的重要疾病之一,引起国内外学者的广泛重视。为培育鹅细小病毒鹅胚成纤维细胞适应毒株,采用在鹅胚上连续传代的方法,培育细胞适应毒株。本研究将原代鹅胚成纤维细胞（GEF）进行连续传代培养,建立了鹅胚成纤维细胞系,并成功传至31代次,传代的GEF具有典型的成纤维细胞形态,培养48h后形成单层细胞。选取不同代次的GEF接种GPV YN分离株,并在GEF中连续传代至F20代,病毒滴度由102.5TCID50/0.1mL达到106.16TCID50/0.1mL,表明GPV已适应GEF,传代至F12代细胞在72h后出现细胞病变。对细胞适应毒F20和亲本病毒F0代进行基因序... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：45 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鹅细小病毒概述
        1.1.1 鹅细小病毒的理化特征
        1.1.2 鹅细小病毒的培养特征
        1.1.3 GPV的分类地位
    1.2 小鹅瘟的研究进展
        1.2.1 小鹅瘟的流行病学特点
        1.2.2 小鹅瘟的临床症状及病理变化
        1.2.3 小鹅瘟的诊断
        1.2.4 小鹅瘟的防治
    1.3 鹅细小病毒的分子生物学特点
        1.3.1 基因组结构
        1.3.2 开放阅读框及编码区的分布
        1.3.3 GPV的结构蛋白
        1.3.4 GPV的非结构蛋白
    1.4 鹅细小病毒适应株的研究进展
        1.4.1 鹅胚和鸭胚适应株的研究进展
        1.4.2 成纤维细胞适应株的研究进展
    1.5 细胞系的概述
        1.5.1 细胞系、细胞株及克隆
        1.5.2 二倍体细胞的转化
    1.6 研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株及实验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 引物设计及序列分析软件
        2.1.5 主要试剂的配置
    2.2 鹅胚成纤维细胞系的建立
        2.2.1 鹅胚成纤维细胞(GEF)的制备
        2.2.2 GEF的传代及纯化
        2.2.3 GEF的冻存与复苏
    2.3 鹅细小病毒细胞适应毒株的培育
        2.3.1 GEF细胞接种鹅细小病毒
        2.3.2 PCR检测
        2.3.3 GEF细胞中病毒增殖检测
        2.3.4 半数感染量(TCID_(50))的测定
    2.4 全基因组的扩增及序列分析
        2.4.1 引物设计与合成
        2.4.2 全基因组扩增
        2.4.3 PCR产物的纯化
        2.4.4 PCR产物与pMD-18T的载体的连接
        2.4.5 氯化钙法制备DH5α
        2.4.6 连接产物的转化
        2.4.7 pMD-18T载体克隆质粒的提取
3 结果
    3.1 鹅胚成纤维细胞系的建立
        3.1.1 原代细胞的生长状况
        3.1.2 传代细胞的生长状况
        3.1.3 细胞的冻存及复苏
    3.2 鹅细小病毒细胞适应毒株的培育
        3.2.1 显微镜观察CPE
        3.2.2 PCR检测
        3.2.3 GEF细胞中的病毒增殖检测
        3.2.4 TCID_(50)测定结果
    3.3 全基因组序列分析
        3.3.1 全基因组扩增
        3.3.2 核苷酸序列分析
        3.3.3 推导的氨基酸序列分析氨基酸
4 讨论
    4.1 鹅胚成纤维细胞系的建立
    4.2 GPV细胞适应株的培育
        4.2.1 小鹅瘟疫苗的研究进展
        4.2.2 细胞适应株的培育
        4.2.3 细胞适应株的特点
    4.3 全基因组序列分析
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立[J]. 刘菲,唐卫杰,程安春,汪铭书,赵婷婷,韩清林,高丽芹.  中国兽医科学. 2011(06)
[2]板蓝根多糖对小鹅瘟病毒体外抑制作用的观察[J]. 李青,许小琴,王志刚,王彬.  中国兽医杂志. 2009(09)
[3]7株鹅细小病毒的克隆序列分析与分子特性[J]. 刘中勇,李福伟,曹宗喜,李惠敏,吴玄光,张桂红.  中国兽医杂志. 2009(07)
[4]用于检测小鹅瘟抗体的Dot-ELISA建立[J]. 布日额,王君伟,吴金花.  中国家禽. 2009(11)
[5]黄芪多糖及其与抗小鹅瘟卵黄抗体协同作用防治小鹅瘟病的研究[J]. 冯敏,杨春华,罗天瑶,戴丽梅,李广运,穆永才.  养殖技术顾问. 2009(03)
[6]小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 付薇,潘杰,龙剑明,朱伟,胡晓静,冯淑萍,何丹,熊毅.  上海畜牧兽医通讯. 2008(06)
[7]小鹅瘟病毒常州株的鉴定及其致弱研究[J]. 金文杰,李清,刘岳龙,秦爱建,刘学贤,王建,邵红霞,施祖灏,蒋小刚,周卫东.  中国家禽. 2008(23)
[8]鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析[J]. 张云,耿宏伟,郭东春,胡奇林,相文华,刘明,杨涛,林巍.  中国预防兽医学报. 2008(06)
[9]鹅细小病毒研究进展[J]. 刘洪雨,王君伟,张君,刘玉芬,董飞.  畜牧兽医科技信息. 2005(08)
[10]鹅细小病毒弱毒株选育的研究[J]. 陈少莺,胡奇林,程晓霞,李怡英,程由铨.  中国预防兽医学报. 2002(04)

博士论文
[1]GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用[D]. 布日额.东北农业大学 2005

硕士论文
[1]小鹅瘟细胞适应毒的培育及其特性的研究[D]. 刘兵.扬州大学 2012



本文编号：3391801