PI3K/Akt信号通路与天然免疫限制性因子SAMHD1在PRRSV感染过程中的作用研究
发布时间：2021-09-11 11:17
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起一种急性、高度传染的病毒性传染病，对世界养猪业造成巨大的经济损失。2006年，我国出现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV），加大了对养猪业的危害。目前，病毒仍在持续的进化，在世界范围内受到广泛关注。PRRSV难以控制的原因之一在于病毒的致病和免疫机理并不十分清楚，因此，难以研发安全、有效的疫苗来对该病进行防控。病毒侵入机体后，机体对侵入的病毒产生一定的限制和清除作用。病毒如何调控细胞内相关信号通路或利用自身编码蛋白来逃避机体免疫系统的识别和清除，从而有利于自身的感染和复制，成为近年来针对PRRSV研究的热点。PI3K/Akt信号通路是细胞内重要的信号转导通路，多种病毒感染过程中均能够活化该通路来有利于自身的复制和增殖。SAMHD1作为最新发现的天然免疫限制性因子，具有三磷酸水解酶的活性，能够降解细胞内d...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述
1.2 PRRSV 的基因组结构与复制机制
1.2.1 PRRSV 的基因组结构
1.2.2 PRRSV 的复制机制
1.3 PRRSV 编码蛋白
1.3.1 PRRSV 的非结构蛋白
1.3.2 PRRSV 的结构蛋白
1.4 PRRSV 感染与先天性免疫
1.4.1 Toll 样受体信号
1.4.2 RIG-I 样受体信号
1.4.3 JAK-STAT 信号通路
1.4.4 PRRSV 感染对天性免疫的调控
1.5 PI3K/Akt 信号通路
1.5.1 PI3K 结构及其生物学功能
1.5.2 Akt 通路及其生物学功能
1.5.3 PI3K/Akt 通路与 PRRSV 感染
1.6 天然免疫限制性因子 SAMHD1 与病毒感染
1.6.1 SAMHD1 的结构与功能
1.6.2 SAMHD1 与病毒感染
1.7 本研究目的和意义
第二章 PRRSV 感染调控 PI3K/Akt 信号通路的研究
2.1 材料和方法
2.1.1 病毒和细胞
2.1.2 抗体和试剂
2.1.3 病毒灭活
2.1.4 病毒感染和抑制剂处理
2.1.5 抑制剂细胞毒性实验
2.1.6 HuN4-F112 株 GSK-3 抑制剂突变株的筛选
2.1.7 细胞裂解和 Western blot 分析
2.1.8 总 RNA 的提取与 cDNA 的合成
2.2 结果
2.2.1 HuN4 感染活化 Akt 信号通路
2.2.2 LY294002 和 GSK-3 inhibitor X 对细胞活性的影响
2.2.3 HuN4 感染 MARC-145 细胞导致 Akt 磷酸化上调受 PI3K 调控
2.2.4 灭活病毒诱导 PAM 细胞 Akt 早期磷酸化
2.2.5 HP-PRRSV 感染调控 Akt 下游分子 FoxO1、Bad 促进自身增殖
2.2.6 抑制 Akt 的磷酸化影响细胞病变（CPE）的形成
2.2.7 Akt 下游分子 GSK-3 的活性与 HuN4 的增殖相关
2.2.8 HuN4-F112 株 GSK-3 抑制剂突变株的筛选
2.3 讨论
第三章 猪 SAMHD1 基因序列扩增及单克隆抗体的制备
3.1 材料与方法
3.1.1 细胞与样品
3.1.2 质粒、抗体和试剂
3.1.3 总 RNA 的提取与 cDNA 的合成
3.1.4 猪 SAMHD1 全基因序列扩增
3.1.5 猪 SAMHD1 蛋白原核表达与纯化
3.2 猪 SAMHD1 蛋白单克隆抗体的制备
3.2.1 小鼠免疫
3.2.2 单克隆抗体的制备
3.2.3 单克隆抗体效价与特异性鉴定
3.3 结果
3.3.1 SAMHD1 全基因序列扩增
3.3.2 猪 SAMHD1 原核表达载体的构建
3.3.3 重组猪 SAMHD1 表达、纯化与鉴定
3.3.4 猪 SAMHD1 单克隆抗体的制备、效价测定与特异性鉴定
3.3.5 IFA 检测内源性猪 SAMHD1 表达
3.4 讨论
第四章 猪 SAMHD1 组织细胞定位及抗病毒作用的研究
4.1 材料与方法
4.1.1 细胞与病毒
4.1.2 质粒、抗体及试剂
4.1.3 总 RNA 提取与 cDNA 的合成
4.1.4 猪 SAMHD1 基因序列分析
4.1.5 真核表达载体的构建与质粒转染
4.1.6 SAMHD1 亚细胞定位与组织分布
4.1.7 过表达 SAMHD1 对 HP-PRRSV 的影响
4.1.8 IFA 检测 HP-PRRSV 的增殖
4.1.9 Strand-specific quantitative RT-PCR (qRT-PCR)检测 HP-PRRSV 增殖
4.1.10 干扰素刺激因子 ISG15 和 ISG56 表达量检测
4.1.11 Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 电泳及 western blot 分析
4.2 结果
4.2.1 猪 SAMHD1 基因序列分析
4.2.2 猪 SAMHD1 亚细胞定位与组织分布
4.2.3 过表达 SAMHD1 显著抑制 HuN4 在 MARC-145 细胞中的增殖
4.2.4 过表达 SAMHD1 蛋白主要以非磷酸化形式存在
4.2.5 过表达 SAMHD1 抑制 HuN4 病毒 cRNA 链的合成
4.2.6 过表达 SAMHD1 显著上调 ISG15 和 ISG56 的转录
4.3 讨论
第五章 SAMHD1 表达调控机制研究
5.1 材料和方法
5.1.1 病毒和细胞
5.1.2 质粒、抗体和试剂
5.1.3 真核表达质粒的构建
5.1.4 Real-time PCR 定量分析 SAMHD1 基因 mRNA 表达量
5.1.5 细胞处理与转染
5.1.6 荧光素酶活性检测
5.1.7 RNA 干扰与回补实验
5.2 结果
5.2.1 IFN-α能显著诱导 MARC-145 细胞和 PAM 细胞中 SAMHD1 的上调表达
5.2.2 TLR3 和 RIG-I 通路参与 SAMHD1 上调表达
5.2.3 TBK1 参与 SAMHD1 的诱导表达
5.2.4 活化的 IRFs 诱导 SAMHD1 的表达
5.2.5 NDV 感染通过磷酸化 IRF-3 上调表达 SAMHD1
5.2.6 抑制 IRF-3 的磷酸化入核无法诱导 SAMHD1 上调表达
5.3 讨论
第六章 PRRSV 感染调控 SAMHD1 机制的研究
6.1 材料与方法
6.1.1 细胞与病毒
6.1.2 质粒、抗体和试剂
6.1.3 细胞样品收取与 real-time RT-PCR 分析 SAMHD1 mRNA 表达
6.1.4 Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 电泳及 western blot
6.1.5 免疫沉淀实验
6.1.6 RNA 干扰实验
6.1.7 抑制剂处理细胞和病毒感染
6.2 结果
6.2.1 PRRSV 感染 MARC-145 细胞和 PAM 细胞 SAMHD1 表达具有一定的差异
6.2.2 HuN4 感染 MARC-145 细胞抑制 IRF-3 的磷酸化
6.2.3 HuN4 病毒感染通过阻止 IRF-3 入核来抑制 SAMHD1 的上调表达
6.2.4 HuN4 感染 MARC-145 细胞直接抑制 IRF-3 的磷酸化
6.2.5 HuN4 感染 PAM 细胞上调 IRF-3 的磷酸化
6.2.6 HuN4 感染 PAM 细胞通过 RIG-I/MDA5/TBK1 通路激活 IRF-3
6.2.7 PAM 细胞中抑制 IRF-3 的磷酸化入核阻止 SAMHD1 的上调表达
6.2.8 抑制 PAM 细胞中 SAMHD1 上调表达促进 HuN4 病毒的增殖
6.2.9 MARC-145 细胞 SAMHD1 处于磷酸化状态
6.2.10 PK-15 细胞中 SAMHD1 处于磷酸化状态
6.2.11 MARC-145 细胞中 SAMHD1 与 CyclinA2/CDK1 互作
6.2.12 PRRSV 感染 MARC-145 细胞促进 CDK1 的活性
6.2.13 抑制 CyclinA2/CDK1 复合体的功能能够阻止 HuN4 病毒的增殖
6.2.14 干扰 MARC-145 细胞中 SAMHD1 的表达对 HuN4 增殖没有显著影响
6.2.15 PRRSV 感染 PAM 细胞 SAMHD1 处于非磷酸化状态
6.2.16 IFN-α诱导 SAMHD1 表达以非磷酸化形式存在
6.3 讨论
第七章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3392903
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述
1.2 PRRSV 的基因组结构与复制机制
1.2.1 PRRSV 的基因组结构
1.2.2 PRRSV 的复制机制
1.3 PRRSV 编码蛋白
1.3.1 PRRSV 的非结构蛋白
1.3.2 PRRSV 的结构蛋白
1.4 PRRSV 感染与先天性免疫
1.4.1 Toll 样受体信号
1.4.2 RIG-I 样受体信号
1.4.3 JAK-STAT 信号通路
1.4.4 PRRSV 感染对天性免疫的调控
1.5 PI3K/Akt 信号通路
1.5.1 PI3K 结构及其生物学功能
1.5.2 Akt 通路及其生物学功能
1.5.3 PI3K/Akt 通路与 PRRSV 感染
1.6 天然免疫限制性因子 SAMHD1 与病毒感染
1.6.1 SAMHD1 的结构与功能
1.6.2 SAMHD1 与病毒感染
1.7 本研究目的和意义
第二章 PRRSV 感染调控 PI3K/Akt 信号通路的研究
2.1 材料和方法
2.1.1 病毒和细胞
2.1.2 抗体和试剂
2.1.3 病毒灭活
2.1.4 病毒感染和抑制剂处理
2.1.5 抑制剂细胞毒性实验
2.1.6 HuN4-F112 株 GSK-3 抑制剂突变株的筛选
2.1.7 细胞裂解和 Western blot 分析
2.1.8 总 RNA 的提取与 cDNA 的合成
2.2 结果
2.2.1 HuN4 感染活化 Akt 信号通路
2.2.2 LY294002 和 GSK-3 inhibitor X 对细胞活性的影响
2.2.3 HuN4 感染 MARC-145 细胞导致 Akt 磷酸化上调受 PI3K 调控
2.2.4 灭活病毒诱导 PAM 细胞 Akt 早期磷酸化
2.2.5 HP-PRRSV 感染调控 Akt 下游分子 FoxO1、Bad 促进自身增殖
2.2.6 抑制 Akt 的磷酸化影响细胞病变（CPE）的形成
2.2.7 Akt 下游分子 GSK-3 的活性与 HuN4 的增殖相关
2.2.8 HuN4-F112 株 GSK-3 抑制剂突变株的筛选
2.3 讨论
第三章 猪 SAMHD1 基因序列扩增及单克隆抗体的制备
3.1 材料与方法
3.1.1 细胞与样品
3.1.2 质粒、抗体和试剂
3.1.3 总 RNA 的提取与 cDNA 的合成
3.1.4 猪 SAMHD1 全基因序列扩增
3.1.5 猪 SAMHD1 蛋白原核表达与纯化
3.2 猪 SAMHD1 蛋白单克隆抗体的制备
3.2.1 小鼠免疫
3.2.2 单克隆抗体的制备
3.2.3 单克隆抗体效价与特异性鉴定
3.3 结果
3.3.1 SAMHD1 全基因序列扩增
3.3.2 猪 SAMHD1 原核表达载体的构建
3.3.3 重组猪 SAMHD1 表达、纯化与鉴定
3.3.4 猪 SAMHD1 单克隆抗体的制备、效价测定与特异性鉴定
3.3.5 IFA 检测内源性猪 SAMHD1 表达
3.4 讨论
第四章 猪 SAMHD1 组织细胞定位及抗病毒作用的研究
4.1 材料与方法
4.1.1 细胞与病毒
4.1.2 质粒、抗体及试剂
4.1.3 总 RNA 提取与 cDNA 的合成
4.1.4 猪 SAMHD1 基因序列分析
4.1.5 真核表达载体的构建与质粒转染
4.1.6 SAMHD1 亚细胞定位与组织分布
4.1.7 过表达 SAMHD1 对 HP-PRRSV 的影响
4.1.8 IFA 检测 HP-PRRSV 的增殖
4.1.9 Strand-specific quantitative RT-PCR (qRT-PCR)检测 HP-PRRSV 增殖
4.1.10 干扰素刺激因子 ISG15 和 ISG56 表达量检测
4.1.11 Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 电泳及 western blot 分析
4.2 结果
4.2.1 猪 SAMHD1 基因序列分析
4.2.2 猪 SAMHD1 亚细胞定位与组织分布
4.2.3 过表达 SAMHD1 显著抑制 HuN4 在 MARC-145 细胞中的增殖
4.2.4 过表达 SAMHD1 蛋白主要以非磷酸化形式存在
4.2.5 过表达 SAMHD1 抑制 HuN4 病毒 cRNA 链的合成
4.2.6 过表达 SAMHD1 显著上调 ISG15 和 ISG56 的转录
4.3 讨论
第五章 SAMHD1 表达调控机制研究
5.1 材料和方法
5.1.1 病毒和细胞
5.1.2 质粒、抗体和试剂
5.1.3 真核表达质粒的构建
5.1.4 Real-time PCR 定量分析 SAMHD1 基因 mRNA 表达量
5.1.5 细胞处理与转染
5.1.6 荧光素酶活性检测
5.1.7 RNA 干扰与回补实验
5.2 结果
5.2.1 IFN-α能显著诱导 MARC-145 细胞和 PAM 细胞中 SAMHD1 的上调表达
5.2.2 TLR3 和 RIG-I 通路参与 SAMHD1 上调表达
5.2.3 TBK1 参与 SAMHD1 的诱导表达
5.2.4 活化的 IRFs 诱导 SAMHD1 的表达
5.2.5 NDV 感染通过磷酸化 IRF-3 上调表达 SAMHD1
5.2.6 抑制 IRF-3 的磷酸化入核无法诱导 SAMHD1 上调表达
5.3 讨论
第六章 PRRSV 感染调控 SAMHD1 机制的研究
6.1 材料与方法
6.1.1 细胞与病毒
6.1.2 质粒、抗体和试剂
6.1.3 细胞样品收取与 real-time RT-PCR 分析 SAMHD1 mRNA 表达
6.1.4 Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 电泳及 western blot
6.1.5 免疫沉淀实验
6.1.6 RNA 干扰实验
6.1.7 抑制剂处理细胞和病毒感染
6.2 结果
6.2.1 PRRSV 感染 MARC-145 细胞和 PAM 细胞 SAMHD1 表达具有一定的差异
6.2.2 HuN4 感染 MARC-145 细胞抑制 IRF-3 的磷酸化
6.2.3 HuN4 病毒感染通过阻止 IRF-3 入核来抑制 SAMHD1 的上调表达
6.2.4 HuN4 感染 MARC-145 细胞直接抑制 IRF-3 的磷酸化
6.2.5 HuN4 感染 PAM 细胞上调 IRF-3 的磷酸化
6.2.6 HuN4 感染 PAM 细胞通过 RIG-I/MDA5/TBK1 通路激活 IRF-3
6.2.7 PAM 细胞中抑制 IRF-3 的磷酸化入核阻止 SAMHD1 的上调表达
6.2.8 抑制 PAM 细胞中 SAMHD1 上调表达促进 HuN4 病毒的增殖
6.2.9 MARC-145 细胞 SAMHD1 处于磷酸化状态
6.2.10 PK-15 细胞中 SAMHD1 处于磷酸化状态
6.2.11 MARC-145 细胞中 SAMHD1 与 CyclinA2/CDK1 互作
6.2.12 PRRSV 感染 MARC-145 细胞促进 CDK1 的活性
6.2.13 抑制 CyclinA2/CDK1 复合体的功能能够阻止 HuN4 病毒的增殖
6.2.14 干扰 MARC-145 细胞中 SAMHD1 的表达对 HuN4 增殖没有显著影响
6.2.15 PRRSV 感染 PAM 细胞 SAMHD1 处于非磷酸化状态
6.2.16 IFN-α诱导 SAMHD1 表达以非磷酸化形式存在
6.3 讨论
第七章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3392903
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