鸭甲型肝炎病毒VP0、VP1截短基因的表达及初步应用
发布时间：2021-09-16 20:16
鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis, DVH）是由小RNA病毒DHV（Duck Hepatitis Virus）引起的一种以雏鸭肝炎和出血为主要病变的传染性极强的疾病。VP0、VP1作为DHV的主要结构蛋白,有很好的免疫原性。通过对VP0、VP1基因截短,筛选出亲水性强的优势抗原区并进行表达,制备了VP0、VP1截短基因的多克隆抗体（PcAb）,建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗原抗体的快速检测方法。1.VP0、VP1截短基因的表达以VP0、VP1基因为模板,经PCR扩增得到VP0F1、VP0F2、VP0F3、VP1F1、 VP1F2共5段序列,将VPOF1-3, VP1F1-2各自拼接得到VP0、VP1截短基因。将VP0、VP1截短基因克隆到表达载体pET28a,构建pET28a-VP0/VP1（截短）重组质粒,在16℃C过夜条件下经IPTG诱导获得VP0、VP1截短蛋白并进行纯化。结果经SDS-PAGE及western blot分析,证明VP0、VP1截短蛋白纯化效果良好,免疫原性强。2.鸭甲型病毒性肝炎抗体间接ELISA检测方法的建立以纯化的VP0截短蛋白为包被抗原...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
文献综述
1 DVH概述
1.1 DHAV的流行及分布
1.2 DHAV的分类地位
1.3 DHAV病原学特性
1.4 DHAV分子生物学特性
1.5 DHAV诊断方法的研究
1.6 截短基因的表达
2 研究目的与意义
材料方法
1 试验材料
1.1 毒株、动物、质粒和血清
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
1.4 主要培养基和溶液的配置
1.4.1 抗生素
1.4.2 培养基类
1.4.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液
1.4.4 Western blot相关溶液
1.4.5 蛋白表达与检测的相关溶液
1.4.6 纯化蛋白相关溶液
1.4.7 纯化抗体相关溶液
1.4.8 ELISA相关溶液
2 方法
2.1 鸭甲型肝炎病毒的增殖与纯化
2.2 VP0、VP1蛋白的分段设计与引物合成
2.3 VP0、VP1截短基因的克隆
2.3.1 病毒RNA的提取
2.3.2 RT-PCR扩增及检测
2.3.3 RT-PCR产物回收与纯化
2.3.4 VP0F1-3、VP1F1-2五段截短基因的回收与纯化
2.3.5 VP0、VP1截短基因与克隆载体的连接
2.3.6 连接产物的转化
2.3.7 重组质粒的鉴定
2.4 重组表达质粒的构建
2.4.1 带有粘性末端VP0、VP1截短基因片段和载体pET28a的制备
2.4.2 VP0、VP1截短基因和载体pET28a的连接、转化及鉴定
2.4.3 重组质粒pET28a-VP0/VP1(截短)质粒的酶切鉴定
2.4.4 重组质粒pET28a-VP0/VP1(截短)质粒的PCR鉴定
2.5 重组质粒的诱导表达及蛋白的纯化
2.5.1 重组质粒的转化
2.5.2 截短蛋白诱导表达最佳条件的摸索
2.5.3 重组蛋白的可溶性分析
2.5.4 重组蛋白的纯化
2.5.5 重组蛋白浓度的测定
2.5.6 重组蛋白Western blot检测
2.6 间接ELISA检测方法的建立
2.6.1 间接ELISA检测方法的操作步骤
2.6.2 重组蛋白最佳包被浓度和最佳血清工作浓度的确定
2.6.3 最佳包被条件的确定
2.6.4 最佳封闭剂和封闭时间的确定
2.6.5 血清最佳作用时间的确定
2.6.6 酶标二抗最佳工作浓度和最佳作用时间的确定
2.6.7 最佳显色时间的确定
2.6.8 阴阳性临界值的确定
2.6.9 特异性试验
2.6.10 敏感性试验
2.6.11 重复性试验
2.6.12 包被抗原保存期试验
2.7 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备
2.7.1 日本大耳白兔的免疫
2.7.2 抗血清的收集
2.7.3 间接ELISA法检测抗体血清效价
2.7.4 多克隆抗体的纯化
2.7.5 多克隆抗体浓度的测定
2.8 夹心ELISA检测方法的建立
2.8.1 夹心ELISA方法的操作程序
2.8.2 捕获抗体的选择
2.8.3 最佳封闭剂和封闭时间的确定
2.8.4 捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度的确定
2.8.5 酶标二抗最佳稀释度的确定
2.8.6 最佳抗原、鸭多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定
2.8.7 最佳显色时间的确定
2.8.8 阴阳性临界值的确定
2.8.9 特异性试验
2.8.10 重复性试验
试验结果
1 鸭甲型肝炎病毒(DHAV-I)的浓度测定
2 VP0、VP1截短基因的克隆表达
2.1 VP0、VP1基因RT-PCR的扩增结果
2.2 VPOF1-3、VP1F1-2基因和VP0、VP1截短基因扩增结果
2.3 pET28a-VP0/VP1(截短)重组表达质粒的鉴定
2.4 截短蛋白诱导表达最佳条件的摸索及表达形式的鉴定
2.5 可溶性截短蛋白的纯化及浓度的测定
2.6 截短蛋白的Western blot结果
3 鸭肝炎病毒VP0截短蛋白间接ELISA检测方法的建立
3.1 VP0截短蛋白最佳包被浓度和鸭血清稀释度的确定
3.2 最佳包被条件的确定
3.3 最佳封闭剂和封闭时间的确定
3.4 血清最佳作用时间的确定
3.5 酶标二抗最佳工作浓度和最佳作用时间的确定
3.6 最佳显色时间的确定
3.7 阴阳性临界值的确定
3.8 特异性试验
3.9 敏感性试验
3.10 重复性试验
3.11 包被抗原保存期试验
4 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备
4.1 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体效价的测定
4.2 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体浓度的测定
5 夹心ELISA检测方法的建立
5.1 捕获抗体的确定
5.2 最佳封闭剂和封闭时间的确定
5.3 捕获抗体和检测抗体最佳浓度的确定
5.4 酶标二抗最佳稀释度的确定
5.5 最佳抗原、鸭多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定
5.6 最佳显色时间的确定
5.7 阴阳性临界值的确定
5.8 特异性试验
5.9 重复性试验
讨论
1 VP0、VP1的截短表达
2 VP0、VP1截短蛋白的分析
3 间接ELISA检测方法
4 夹心ELISA检测方法
结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用[J]. 郝明飞,张秀美,胡北侠,张琳,许传田,杨少华,李建亮,陈正涛,崔言顺. 中国兽医学报. 2012(08)
[2]新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析[J]. 赵金花,沈志强,朱辉,李峰,甄洪花,苗立中,单虎. 中国预防兽医学报. 2011(10)
[3]新型鸭肝炎病毒的分离鉴定[J]. 范书才,李虹,袁率珍,巢伟,王少英,林旭野,张毓金,朱山林,张兵,姜畔,范小舟. 中国预防兽医学报. 2009(10)
[4]鸭肝炎病毒基因的生物信息学分析及多聚蛋白的加工预测[J]. 聂奎,胡燕宾,曾兴艳,周作勇. 中国预防兽医学报. 2009(06)
[5]鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立[J]. 马秀丽,宋敏训,于可响,廖明,辛朝安. 微生物学报. 2008(08)
[6]Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J]. 马秀丽,宋敏训,黄兵,廖明,辛朝安. 家禽科学. 2006(11)
[7]Ⅱ型鸭肝炎病毒变异株的鉴定[J]. 郑献进,张大丙,曲丰发,丁春宇. 中国兽医杂志. 2006(05)
[8]鸭病毒性肝炎诊断技术研究进展[J]. 赵瑞宏,张小飞,魏建忠,潘孝成. 动物医学进展. 2006(04)
[9]鸭肝炎病毒单克隆抗体的研制[J]. 杨萍萍,宋敏训,艾武,马秀丽,崔言顺. 中国预防兽医学报. 2006(02)
[10]大肠杆菌表达系统的研究进展[J]. 戎晶晶,刁振宇,周国华. 药物生物技术. 2005(06)
硕士论文
[1]Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及间接ELISA方法的建立[D]. 张蕾.东北农业大学 2013
[2]Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒分离鉴定及实时荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 陈玉环.东北农业大学 2013
[3]一种用于A型鸭甲肝病毒检测的类病毒颗粒制备[D]. 秦冲.华中农业大学 2013
[4]禽白血病抗原和抗体ELISA检测方法的建立[D]. 谢华丽.华中农业大学 2013
[5]J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及初步应用[D]. 刘丽娜.华中农业大学 2012
[6]Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3截短基因的表达及应用[D]. 罗玄.安徽农业大学 2012
[7]1型鸭肝炎病毒VP0基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立[D]. 陈敏.华中农业大学 2010
[8]DHV-Ⅰ抗体乳胶凝集试剂盒的研制和间接ELISA方法的建立[D]. 彭婉芬.华中农业大学 2008
[9]1型鸭肝炎病毒JX株基因组序列分析及VP0、VP1基因的原核表达[D]. 张玮.华中农业大学 2008
[10]鸭肝炎病毒的分离鉴定及ELISA检测抗原、抗体方法的建立[D]. 韩永俊.华中农业大学 2007
本文编号：3397224
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
文献综述
1 DVH概述
1.1 DHAV的流行及分布
1.2 DHAV的分类地位
1.3 DHAV病原学特性
1.4 DHAV分子生物学特性
1.5 DHAV诊断方法的研究
1.6 截短基因的表达
2 研究目的与意义
材料方法
1 试验材料
1.1 毒株、动物、质粒和血清
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
1.4 主要培养基和溶液的配置
1.4.1 抗生素
1.4.2 培养基类
1.4.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液
1.4.4 Western blot相关溶液
1.4.5 蛋白表达与检测的相关溶液
1.4.6 纯化蛋白相关溶液
1.4.7 纯化抗体相关溶液
1.4.8 ELISA相关溶液
2 方法
2.1 鸭甲型肝炎病毒的增殖与纯化
2.2 VP0、VP1蛋白的分段设计与引物合成
2.3 VP0、VP1截短基因的克隆
2.3.1 病毒RNA的提取
2.3.2 RT-PCR扩增及检测
2.3.3 RT-PCR产物回收与纯化
2.3.4 VP0F1-3、VP1F1-2五段截短基因的回收与纯化
2.3.5 VP0、VP1截短基因与克隆载体的连接
2.3.6 连接产物的转化
2.3.7 重组质粒的鉴定
2.4 重组表达质粒的构建
2.4.1 带有粘性末端VP0、VP1截短基因片段和载体pET28a的制备
2.4.2 VP0、VP1截短基因和载体pET28a的连接、转化及鉴定
2.4.3 重组质粒pET28a-VP0/VP1(截短)质粒的酶切鉴定
2.4.4 重组质粒pET28a-VP0/VP1(截短)质粒的PCR鉴定
2.5 重组质粒的诱导表达及蛋白的纯化
2.5.1 重组质粒的转化
2.5.2 截短蛋白诱导表达最佳条件的摸索
2.5.3 重组蛋白的可溶性分析
2.5.4 重组蛋白的纯化
2.5.5 重组蛋白浓度的测定
2.5.6 重组蛋白Western blot检测
2.6 间接ELISA检测方法的建立
2.6.1 间接ELISA检测方法的操作步骤
2.6.2 重组蛋白最佳包被浓度和最佳血清工作浓度的确定
2.6.3 最佳包被条件的确定
2.6.4 最佳封闭剂和封闭时间的确定
2.6.5 血清最佳作用时间的确定
2.6.6 酶标二抗最佳工作浓度和最佳作用时间的确定
2.6.7 最佳显色时间的确定
2.6.8 阴阳性临界值的确定
2.6.9 特异性试验
2.6.10 敏感性试验
2.6.11 重复性试验
2.6.12 包被抗原保存期试验
2.7 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备
2.7.1 日本大耳白兔的免疫
2.7.2 抗血清的收集
2.7.3 间接ELISA法检测抗体血清效价
2.7.4 多克隆抗体的纯化
2.7.5 多克隆抗体浓度的测定
2.8 夹心ELISA检测方法的建立
2.8.1 夹心ELISA方法的操作程序
2.8.2 捕获抗体的选择
2.8.3 最佳封闭剂和封闭时间的确定
2.8.4 捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度的确定
2.8.5 酶标二抗最佳稀释度的确定
2.8.6 最佳抗原、鸭多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定
2.8.7 最佳显色时间的确定
2.8.8 阴阳性临界值的确定
2.8.9 特异性试验
2.8.10 重复性试验
试验结果
1 鸭甲型肝炎病毒(DHAV-I)的浓度测定
2 VP0、VP1截短基因的克隆表达
2.1 VP0、VP1基因RT-PCR的扩增结果
2.2 VPOF1-3、VP1F1-2基因和VP0、VP1截短基因扩增结果
2.3 pET28a-VP0/VP1(截短)重组表达质粒的鉴定
2.4 截短蛋白诱导表达最佳条件的摸索及表达形式的鉴定
2.5 可溶性截短蛋白的纯化及浓度的测定
2.6 截短蛋白的Western blot结果
3 鸭肝炎病毒VP0截短蛋白间接ELISA检测方法的建立
3.1 VP0截短蛋白最佳包被浓度和鸭血清稀释度的确定
3.2 最佳包被条件的确定
3.3 最佳封闭剂和封闭时间的确定
3.4 血清最佳作用时间的确定
3.5 酶标二抗最佳工作浓度和最佳作用时间的确定
3.6 最佳显色时间的确定
3.7 阴阳性临界值的确定
3.8 特异性试验
3.9 敏感性试验
3.10 重复性试验
3.11 包被抗原保存期试验
4 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备
4.1 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体效价的测定
4.2 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体浓度的测定
5 夹心ELISA检测方法的建立
5.1 捕获抗体的确定
5.2 最佳封闭剂和封闭时间的确定
5.3 捕获抗体和检测抗体最佳浓度的确定
5.4 酶标二抗最佳稀释度的确定
5.5 最佳抗原、鸭多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定
5.6 最佳显色时间的确定
5.7 阴阳性临界值的确定
5.8 特异性试验
5.9 重复性试验
讨论
1 VP0、VP1的截短表达
2 VP0、VP1截短蛋白的分析
3 间接ELISA检测方法
4 夹心ELISA检测方法
结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用[J]. 郝明飞,张秀美,胡北侠,张琳,许传田,杨少华,李建亮,陈正涛,崔言顺. 中国兽医学报. 2012(08)
[2]新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析[J]. 赵金花,沈志强,朱辉,李峰,甄洪花,苗立中,单虎. 中国预防兽医学报. 2011(10)
[3]新型鸭肝炎病毒的分离鉴定[J]. 范书才,李虹,袁率珍,巢伟,王少英,林旭野,张毓金,朱山林,张兵,姜畔,范小舟. 中国预防兽医学报. 2009(10)
[4]鸭肝炎病毒基因的生物信息学分析及多聚蛋白的加工预测[J]. 聂奎,胡燕宾,曾兴艳,周作勇. 中国预防兽医学报. 2009(06)
[5]鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立[J]. 马秀丽,宋敏训,于可响,廖明,辛朝安. 微生物学报. 2008(08)
[6]Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J]. 马秀丽,宋敏训,黄兵,廖明,辛朝安. 家禽科学. 2006(11)
[7]Ⅱ型鸭肝炎病毒变异株的鉴定[J]. 郑献进,张大丙,曲丰发,丁春宇. 中国兽医杂志. 2006(05)
[8]鸭病毒性肝炎诊断技术研究进展[J]. 赵瑞宏,张小飞,魏建忠,潘孝成. 动物医学进展. 2006(04)
[9]鸭肝炎病毒单克隆抗体的研制[J]. 杨萍萍,宋敏训,艾武,马秀丽,崔言顺. 中国预防兽医学报. 2006(02)
[10]大肠杆菌表达系统的研究进展[J]. 戎晶晶,刁振宇,周国华. 药物生物技术. 2005(06)
硕士论文
[1]Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及间接ELISA方法的建立[D]. 张蕾.东北农业大学 2013
[2]Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒分离鉴定及实时荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 陈玉环.东北农业大学 2013
[3]一种用于A型鸭甲肝病毒检测的类病毒颗粒制备[D]. 秦冲.华中农业大学 2013
[4]禽白血病抗原和抗体ELISA检测方法的建立[D]. 谢华丽.华中农业大学 2013
[5]J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及初步应用[D]. 刘丽娜.华中农业大学 2012
[6]Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3截短基因的表达及应用[D]. 罗玄.安徽农业大学 2012
[7]1型鸭肝炎病毒VP0基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立[D]. 陈敏.华中农业大学 2010
[8]DHV-Ⅰ抗体乳胶凝集试剂盒的研制和间接ELISA方法的建立[D]. 彭婉芬.华中农业大学 2008
[9]1型鸭肝炎病毒JX株基因组序列分析及VP0、VP1基因的原核表达[D]. 张玮.华中农业大学 2008
[10]鸭肝炎病毒的分离鉴定及ELISA检测抗原、抗体方法的建立[D]. 韩永俊.华中农业大学 2007
本文编号：3397224
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