弓形虫CDPK1-EF基因的克隆表达及其免疫学特性研究

发布时间：2021-09-25 14:25

　　弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）寄生于人和多种动物有核细胞内所引起的人兽共患原虫病,该病广泛流行于世界各地。弓形虫不仅对人类健康构成严重威胁,还给畜牧业生产造成严重经济损失。目前,弓形虫病的防治主要通过化学治疗方法,但其存在副作用大、易复发、易产生抗药性以及畜禽产品的药物残留等弊端,因此,开展对弓形虫病流行特点以及弓形虫疫苗的研究是当前该领域重要方向之一,研制安全、高效的疫苗是预防弓形虫病首选策略。CDPKs是一类不依赖钙调素的蛋白激酶,其可参与调控寄生虫的入侵、外出宿主细胞、配子的形成、在宿主体内移行等关键生理活动,是弓形虫发育过程中重要的功能蛋白之一。然而,目前关于该对弓形虫CDPKs的免疫保护力的研究资料较为匮乏,因此,对其深入研究不仅有助于阐明该抗原作用的免疫机制,同时也为其作为弓形虫疫苗候选抗原的筛选提供基本依据。首先,采用RT-PCR技术对弓形虫RH株速殖子钙依赖蛋白激酶EF模体（TgCDPKl-EF）基因进行体外扩增、测序,将目的片段的核酸序列及其编码氨基酸序列与已公布的、在分类上相近的其他原虫该蛋白的相同区域进行... 

【文章来源】：安徽农业大学安徽省

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

间接免疫酶化学染色法检测弓形虫速殖子TgCDPKI的表达分布

２．１４小鼠免疫及攻虫后免疫相关因子的ｍＲＮＡ表达水平??采用巧光定量ＰＣＲ相对定量法检测空白对照组、重組蛋白免疫组、免疫攻虫组、??空白攻虫组各采样点赃脏组织中细胞因子相对于内参片－〇如＇Ｍ的表达水平，结果如图??２－１８所示，与空白对照组相比，用重组蛋白免疫后小鼠脾脏中的介导体液免疫的细胞??因子化Ｗ及介导细胞免疫的细胞因子／／Ｗ－?ｒ的ｍＲＮＡ表达均明显上调，Ｈ免后第??７ｄ化在转录水平上上调９．２倍，／／＝Ｗ－?Ｋ上调５．７倍，在统计学上达到差异极湿著（Ｐ??＜０．０１）；攻虫后３ｄ及攻虫后５ｄ时，化－４在转录水平上分别上调１１．５倍和１１倍，而??／仍Ｖ－Ｆ在转录水平上明显上调，分别为空白对照组的５．７倍和５．５倍，均达到达到极??显著水平（Ｐ＜０．０１）。对未免疫小鼠的攻虫后相对定量其细胞因子ｍＲＮＡ的表达量发??现，在攻虫后第３ｄ时，小鼠的化－４？衷达比空白对照组上调７．８倍，达到极显著差异（Ｐ??＜０．０１），而上调３．３倍，具有显著差异（Ｐ＜０．０５）。未免疫小鼠攻虫后第５ｄ??已经出现发病症状，各细胞因子ｍＲＮＡ的表达量与空白对照组比较均显著降低，结??果达到极思著差异（Ｐ＜化０１）。??对各组小鼠７１知４的ｍＲＮＡ表达量相对定量分析表明，除了处于典型发病期的??＂空白攻虫５ｄ＂组的实验小鼠之外，其余各组的７７：知細民ＮＡ的表达量与空白对照??

２．１０最佳抗原、抗体稀释度??体外表达融合蛋白纯化后稀释至浓度为ｌＯｆｉｇ／ｍＬ作为包被抗原，采用Ｅｌｉｓａ棋盘??法确定最佳抗原浓度，实验结果显示：将抗原释至２．５｜ｉｇ／ｒｎＬ（ｌ：４），血清稀释至１：２００??倍时可获得最大的Ｐ／Ｎ值（即１．８％９／０．１４５８＝１２．７３巧）。??２．１１抗体滴度??重组蛋白经佐剂乳化后作为免疫原对小鼠进行Ｈ次免疫后，运用间接ＥＬＩＳＡ法??测定免疫小鼠血清的抗体效价，其ＩｇＧ特异性抗体的平均效价为１：?１４９３３。??２．口黄光定量ＰＣ民反应体系与条件优化??针对不各基因的ｃＤＮＡ浓度，出现最小的ＣＴ值、最大英光值Ｗ及在溶解曲线??中不出现非特异峰为指标，分别对退火温度及引物浓度进行优化。分别获得ＩＸ欠４、??化及７Ｆ７Ｖ－?ｒ相对于内参基因口如’Ｍ的最佳反应体系与反应条件。??秦２－２知￡７如＂及化的最佳反应体系与条件??

【参考文献】：
期刊论文
[1]顶复门原虫钙依赖蛋白激酶的研究进展[J]. 张念章,陈佳,王萌,朱兴全,黄思扬.  畜牧兽医学报. 2013(01)
[2]中国养殖业可持续发展战略研究综合报告[J]. 李宁,中国养殖业可持续发展战略研究综合报告课题组.  中国家禽. 2012(11)
[3]柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析[J]. 孔春林,韩红玉,李洋,董辉,姜连连,李婷,赵其平,朱顺海,黄兵.  生物技术通报. 2012(04)
[4]弓形虫病研究概况[J]. 王跃兵,杨向东,杨国荣,于彬彬,黄文丽,马永康.  中国热带医学. 2012(04)
[5]顶复门原虫入侵相关因子的研究进展[J]. 戚南山,孙铭飞,廖申权,吴彩艳,吕敏娜,袁建丰,余劲术,李祥瑞,蔡建平.  畜牧兽医学报. 2012(02)
[6]弓形虫慢性感染大鼠脑组织中Toll样受体4基因表达及其对脑损害影响[J]. 周永华,王尚尚,杨静,陶建平,许永良,黄玉政,高琪.  中国血吸虫病防治杂志. 2012(01)
[7]弓形虫病疫苗研究进展[J]. 赵蕾,于新友,王金良,李坤林.  中国兽药杂志. 2011(06)
[8]弓形虫主要表面抗原的研究进展[J]. 何勇,周鹏,尹创成,袁子国,林瑞庆.  畜牧与兽医. 2010(05)
[9]弓形虫病的流行的新趋势[J]. 李祥瑞.  动物医学进展. 2010(S1)
[10]顶复器原虫钙依赖蛋白激酶的研究进展[J]. 李洋,韩红玉,黄兵.  热带医学杂志. 2010(02)

硕士论文
[1]地域差异对中国猫源弓形虫基因分型和毒力影响的研究[D]. 陈兆武.安徽医科大学 2011
[2]湖北省规模化猪场弓形虫病流行病学调查及弓形虫磺胺抗药性的初步研究[D]. 王正松.华中农业大学 2009



本文编号：3409899