猪链球菌2型STPK和STPP蛋白与双组分系统及ABC转运子的相互作用
发布时间：2021-09-30 03:26
猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）是一种重要的人畜共患病病原,近年来对我国养殖业造成了巨大的损失,然而其致病机制尚不清楚。在原核生物中,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/threonine protein kinases, STPK）和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（Serine/threonine phosphatases, STPP）能使特定底物蛋白中丝氨酸或苏氨酸羟基磷酸化/去磷酸化,催化多种功能蛋白的磷酸化/去磷酸化,从而参与到复杂的信号通路中,直接或间接调控基因的转录、代谢途径、免疫调节、细菌的分裂和毒力和应激反应中。细菌的ABC转运子（ABC-transporters）系统是细胞物质运输体系的重要组成部分,猪链球菌2型的ABC转运子与细菌的生长和毒力相关,推测参与STPK蛋白和STPP蛋白调控系统。另外,细菌的双组分系统（Two-component system, TCS）广泛分布于细菌中,能够调控有机体基因的表达来适应外界环境的变化和刺激,且在调控细胞周期、致病性等生理过程中起重要的作用,推测参与STPK蛋白和STPP蛋白调控系统。本课题主要是通...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 丝/苏氨酸蛋白激酶(STPK)和磷酸酶(STPP)
1.1.1 STPK和STPP的概况
1.1.2 真核生物中的STPK和STPP
1.1.3 原核生物中的STPK和STPP
1.2 猪链球菌2型的双组份系统
1.3 猪链球菌2型的ABC转运子系统
1.4 蛋白质相互作用网络
1.4.1 蛋白质相互作用网络的意义
1.4.2 蛋白质相互作用研究方法
1.4.3 蛋白质相互作用网络的研究进展
1.4.4 蛋白质互作的评估
2 目的和意义
3 材料方法
3.1 菌株和质粒
3.2 主要试剂
3.3 质粒构建培养基、抗生素配制
3.4 细菌双杂交筛选所需培养基、缓冲液配制
3.5 引物的设计和合成
3.6 诱饵质粒及网络蛋白质粒的构建
3.6.1 以SSU05基因组为模板进行基因组扩增
3.6.2 PCR产物的纯化
3.6.3 酶切反应及酶切产物的回收
3.6.4 外源片段与载体的连接
3.6.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.6.6 连接产物的转化
3.6.7 质粒的小量提取
3.6.8 质粒的酶切鉴定
3.7 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒的共转化及选择性培养
3.7.1 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒的共转化
3.7.2 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒自激活检测
3.7.3 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒选择性培养
3.8 PCR初步鉴定共转结果
3.9 重组质粒的构建和蛋白的表达和纯化
3.9.1 重组质粒的构建
3.9.2 pGEX-KG-PknB在大肠杆菌中表达和纯化
3.9.3 pET-28c与宿主蛋白融合蛋白的表达和纯化
4 结果与分析
4.1 pBT和pTRG载体的分析和改造
4.2 双组分文库的构建
4.2.1 双组分文库基因的扩增
4.2.2 双组分文库重组质粒的构建
4.3 ABC转运子文库的构建
4.3.1 ABC转运子文库基因的扩增
4.3.2 ABC转运子文库重组质粒的构建
4.4 STPK互作网络的研究
4.4.1 STPK同源性的比较
4.4.2 STPK诱饵质粒的构建
4.4.3 细菌双杂交筛选STPK与双组分系统的互作
4.4.4 细菌双杂交筛选STPK与ABC转运子的互作
4.4.5 STPK与双组分和ABC转运子系统互作的拓扑图
4.4.6 STPK与双组分系统阳性互作蛋白载体的构建
4.4.7 STPK与双组分系统阳性互作蛋白的表达和纯化
4.5 STPP互作网络的研究
4.5.1 STPP诱饵质粒的构建
4.5.2 细菌双杂交筛选STPP与双组分系统的互作
4.5.3 细菌双杂交筛选STPP与ABC转运子的互作
4.5.4 STPP与双组分和ABC转运子系统互作的拓扑图
5 讨论与结论
5.1 讨论
5.2 结论
参考文献
附表
致谢
本文编号：3415030
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 丝/苏氨酸蛋白激酶(STPK)和磷酸酶(STPP)
1.1.1 STPK和STPP的概况
1.1.2 真核生物中的STPK和STPP
1.1.3 原核生物中的STPK和STPP
1.2 猪链球菌2型的双组份系统
1.3 猪链球菌2型的ABC转运子系统
1.4 蛋白质相互作用网络
1.4.1 蛋白质相互作用网络的意义
1.4.2 蛋白质相互作用研究方法
1.4.3 蛋白质相互作用网络的研究进展
1.4.4 蛋白质互作的评估
2 目的和意义
3 材料方法
3.1 菌株和质粒
3.2 主要试剂
3.3 质粒构建培养基、抗生素配制
3.4 细菌双杂交筛选所需培养基、缓冲液配制
3.5 引物的设计和合成
3.6 诱饵质粒及网络蛋白质粒的构建
3.6.1 以SSU05基因组为模板进行基因组扩增
3.6.2 PCR产物的纯化
3.6.3 酶切反应及酶切产物的回收
3.6.4 外源片段与载体的连接
3.6.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.6.6 连接产物的转化
3.6.7 质粒的小量提取
3.6.8 质粒的酶切鉴定
3.7 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒的共转化及选择性培养
3.7.1 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒的共转化
3.7.2 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒自激活检测
3.7.3 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒选择性培养
3.8 PCR初步鉴定共转结果
3.9 重组质粒的构建和蛋白的表达和纯化
3.9.1 重组质粒的构建
3.9.2 pGEX-KG-PknB在大肠杆菌中表达和纯化
3.9.3 pET-28c与宿主蛋白融合蛋白的表达和纯化
4 结果与分析
4.1 pBT和pTRG载体的分析和改造
4.2 双组分文库的构建
4.2.1 双组分文库基因的扩增
4.2.2 双组分文库重组质粒的构建
4.3 ABC转运子文库的构建
4.3.1 ABC转运子文库基因的扩增
4.3.2 ABC转运子文库重组质粒的构建
4.4 STPK互作网络的研究
4.4.1 STPK同源性的比较
4.4.2 STPK诱饵质粒的构建
4.4.3 细菌双杂交筛选STPK与双组分系统的互作
4.4.4 细菌双杂交筛选STPK与ABC转运子的互作
4.4.5 STPK与双组分和ABC转运子系统互作的拓扑图
4.4.6 STPK与双组分系统阳性互作蛋白载体的构建
4.4.7 STPK与双组分系统阳性互作蛋白的表达和纯化
4.5 STPP互作网络的研究
4.5.1 STPP诱饵质粒的构建
4.5.2 细菌双杂交筛选STPP与双组分系统的互作
4.5.3 细菌双杂交筛选STPP与ABC转运子的互作
4.5.4 STPP与双组分和ABC转运子系统互作的拓扑图
5 讨论与结论
5.1 讨论
5.2 结论
参考文献
附表
致谢
本文编号：3415030
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