山羊瘤胃原虫与细菌之间氮周转规律与机制的研究

发布时间：2021-09-30 08:02

　　目前反刍动物氮利用效率偏低（G. Lobely, J. MacRea）,其原因可能是：饲料氮源随动物粪尿的排出；日粮优质蛋白的降解；微生物蛋白在瘤胃内的再循环。在瘤胃微生态系统中,原虫的吞噬行为、自溶现象以及高的脱氨基活性都可能加剧瘤胃内氮素的无效循环,降低氮的利用效率。为此,本课题从动态角度,结合微生态瘤胃内环境、微生物氮周转、微生物活性、微生物区系变化及主要微生物相对数量的变化,系统地探讨瘤胃原虫与细菌之间氮周转的规律及其机制。在生产中可采用有效的营养调控措施,提高反刍动物对氮的利用效率。第一章瘤胃原虫与细菌之间氮周转研究方法的建立本试验旨在探讨荧光光度法研究瘤胃原虫对细菌吞噬作用的可行性。试验选用4只装有永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊采集瘤胃液以获取瘤胃原虫和细菌,以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记细菌的荧光强度为主要测定指标,研究山羊瘤胃中原虫对细菌的吞噬作用。结果表明,DAPI标记的瘤胃细菌浓度与其荧光强度之间存在线性相关（R2=0.9952）。在日粮粗精比为7：3的条件下,徐淮山羊瘤胃原虫对细菌的吞噬速率为370.89cells/（cell·h）,瘤胃内原虫对细菌的... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：165 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
符号说明
第一篇 文献综述
    第一章 反刍动物瘤胃微生物对含氮物质的代谢研究
        1. 反刍动物瘤胃内氮源物质的转化
        2. 瘤胃微生物对含氮物质的利用研究
            2.1 瘤胃细菌对饲料中不同含氮物质的利用
                2.1.1 瘤胃细菌对蛋白的降解
                2.1.2 不同含氮物质对瘤胃细菌的促生长作用
            2.2 瘤胃原虫对不同形式含氮物质的利用
            2.3 瘤胃真菌对不同含氮物质的利用
            2.4 瘤胃微生物在蛋白降解中的协同作用
        3 影响瘤胃微生物降解蛋白质的因素
            3.1 蛋白质类型的影响
            3.2 日粮类型的影响
            3.3 其他因素的影响
        4. 瘤胃微生物蛋白质的合成代谢及其影响因素
            4.1 瘤胃微生物蛋白质合成代谢概况
            4.2 微生物蛋白合成的影响因素
                4.2.1 氮源
                4.2.2 能量
                4.2.3 温度
                4.2.4 瘤胃液pH值和稀释率
                4.2.5 蛋白质和碳水化合物消化的同步性
    第二章 瘤胃原虫与细菌之间氮周转的研究进展
        1. 瘤胃内微生物氮代谢的研究
            1.1 微生物氮代谢相关指标
                1.1.1 微生物蛋白合成效率
                1.1.2 微生物氮占可利用氮的比例
        2. 瘤胃微生物氮循环研究
            2.1 研究方法
                2.1.1 微生物蛋白合成率的研究方法
                2.1.2 原虫与细菌之间吞噬关系的研究方法
                    (1) 同位素标记法
                    (2) 荧光标记法
            2.2. 微生物氮循环影响因素
        3. 本课题的导出
        4 理论假说的提出
            4.1 理论假说与机制
            4.2 理论假说的机理假定
        5. 实验论证的技术路线
            5.1 DAPI荧光强度法研究瘤胃原虫对细菌的吞噬关系
            5.2 瘤胃原虫与细菌之间氮周转规律与机制的研究
        6. 研究意义及目标
第二篇 试验研究
    第一章 瘤胃原虫与细菌之间氮周转方法的建立
        引言
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
            1.2 试验动物
            1.3 试验方法
                1.3.1 瘤胃细菌与原虫的分离
                1.3.2 DAPI荧光标记瘤胃细菌
                1.3.3 吞噬试验
                1.3.4 荧光强度测定
            1.4 数据处理
        2 结果与分析
            2.1 DAPI荧光标记瘤胃细菌标准曲线的建立
                2.1.1 标准曲线中标记细菌浓度的设置
                2.1.2 标准曲线的建立
            2.2 不同吞噬时间点游离细菌荧光强度的变化
            2.3 瘤胃原虫对细菌的吞噬率及吞噬量
                2.3.1 原虫对细菌吞噬量的计算
                2.3.2 瘤胃原虫对细菌的吞噬率及吞噬量结果
        3 讨论
        4 小结
    第二章 不同日粮精粗比对瘤胃原虫与细菌之间氮周转的影响
        引言
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
                1.1.1 试验动物与饲养管理
                1.1.2 瘤胃液的采集
                1.1.3 体外发酵装置
                1.1.4 人工唾液配方
                    1.1.4.1 缓冲试剂和常量元素溶液——A液
                    1.1.4.2 微量元素溶液——B液
                    1.1.4.3 维生素溶液——C液
                    1.1.4.4 还原剂溶液——D液
                    1.1.4.5 缓冲液制备
                    1.1.4.6 供试培养液
            1.2 试验设计
            1.3 测定指标与方法
                1.3.1 常规指标测定方法
                    1.3.1.1 微生物的分离
                    1.3.1.2 pH值的测定
                    1.3.1.3 氨氮浓度的测定
                    1.3.1.4 微生物真蛋白的测定
                    1.3.1.5 可溶性蛋白的测定
                    1.3.1.6 培养液肽氮的测定
                    1.3.1.7 培养液AA-N的测定
                    1.3.1.8 微生物计数
                1.3.2 SSCP检测
                    1.3.2.1 瘤胃微生物基因组DNA的提取
                    1.3.2.2 原虫与细菌保守区域片段的扩增
                    1.3.2.3 SSCP检测(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)
                    1.3.2.4 SSCP指纹图谱分析
                1.3.3 三种重要蛋白降解菌的定量检测
                    1.3.3.1 DNA浓度的测定
                    1.3.3.2 保守区域片段的扩增
            1.4 计算公式
            1.5 统计分析
        2 结果与分析
            2.1 精粗比对发酵参数的影响
                2.1.1 精粗比对培养液pH的影响
                2.1.2 精粗比对培养液氨氮浓度的影响
            2.2 精粗比对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                2.2.1 对细菌氮、原虫氮及微生物总氮周转速率的影响
                2.2.2. 对原虫吞噬细菌量和吞噬速率的影响
                    2.2.2.4 相关性分析
                        2.2.2.4.1 微生物氮周转速率之间的相关性分析
                        2.2.2.4.2 微生物氮之间周转速率动态变化的相关性分析
                    2.2.2.5 微生物氮周转速率与底物精粗比值的回归分析
                2.2.3 精粗比对培养液中主要含氮物质组分的影响
                2.2.4 瘤胃内环境总氮与瘤胃内环境中各主要形式氮之间周转速率动态变化的相关性分析
            2.3 精粗比对微生物区系的影响
                2.3.1 精粗比对微生物区系比例的影响
                2.3.2 PCR-SSCP分析
                    2.3.2.1 PCR扩增结果
                    2.3.2.2 SSCP多态性分析
            2.4 三种重要蛋白降解菌的定量分析
        3 讨论
            3.1 不同精粗比对瘤胃内环境参数的影响
                3.1.1 精粗比对pH的影响
                3.1.2 精粗比对培养液氨氮浓度的影响
            3.2 对微生物与瘤胃内环境间含氮物质周转的影响
                3.2.1 瘤胃微生态氮素微循环研究方法的探讨
                3.2.2 对微生物氮素周转的影响
                3.2.3 对微生物蛋白产量的影响
                3.2.4 对微生物氮素周转的影响
                3.2.5 对原虫吞噬细菌量和吞噬速率的影响
                3.2.6 对瘤胃内环境中氮素周转的影响
            3.3 对微生物区系及区系内类群结构的影响
        4 小结
    第三章 不同碳源结构NSC/SC对瘤胃原虫与细菌间氮周转的影响
        引言
        1 材料与方法
            1.1 试验设计
            1.2 测定指标与方法
            1.3 增测指标
            1.4 测定方法
                1.4.1 VFA的测定
                1.4.2 肽酶活性的测定
                1.4.3 蛋白酶活性的测定
                1.4.4 原虫细胞膜破碎方法
        2 结果与分析
            2.1 不同NSC/SC日粮对培养液内瘤胃内环境参数的影响
                2.1.1 不同NSC/SC日粮对培养液pH的影响
                2.1.2 不同NSC/SC日粮对培养液氨氮浓度的影响
                2.1.3 不同NSC/SC日粮对培养液挥发性脂肪酸(VFA)的影响
            2.2 不同NSC/SC纯合日粮对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                2.2.1 对微生物蛋白含量的影响
                2.2.2 不同NSC/SC对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                    2.2.2.1 对细菌氮、原虫氮及微生物总氮周转速率的影响
                    2.2.2.2 对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                    2.2.2.3 统计分析
                        2.2.2.3.1 微生物之间氮周转速率的相关性分析
                        2.2.2.3.2 微生物氮之间周转速率动态变化的相关性分析
                        2.2.2.3.3 氮周转速率与底物NSC/SC值的回归分析
                2.2.3 对培养液中主要含氮物质组分的影响
                2.2.4 瘤胃内环境总氮与瘤胃内环境中各主要形式氮之间周转速率动态变化的相关性分析
            2.3 不同NSC/SC日粮对原虫胞内、外肽酶和蛋白酶活性的影响
            2.4 不同NSC/SC日粮对微生物区系的影响
                2.4.1 对微生物区系比例的影响
                2.4.2 PCR-SSCP分析
                    2.4.2.1 PCR扩增结果
                    2.4.2.2 SSCP多态性分析
            2.5 三种重要蛋白降解菌的定量分析
        3 讨论
            3.1 不同NSC/SC对瘤胃发酵参数的影响
                3.1.1 对pH值的影响
                3.1.2 对氨氮浓度的影响
                3.1.3 对培养液中挥发性脂肪酸(VFA)浓度的影响
            3.2 不同NSC/SC对微生物氮素周转的影响
            3.3 不同NSC/SC对瘤胃内环境氮素周转的影响
            3.4 不同NSC/SC对微生物活性的影响
        4 小结
    第四章 不同分子结构氮源对瘤胃原虫与细菌间氮周转的影响
        引言
        1 材料与方法
            1.1 试验设计
            1.2 测定指标与方法
            1.3 统计分析
        2 结果与分析
            2.1 不同分子结构氮源对培养液内瘤胃内环境参数的影响
                2.1.1 对培养液pH的影响
                2.1.2 对培养液氨氮浓度的影响
                2.1.3 对培养液挥发性脂肪酸(VFA)的影响
            2.2 不同分子结构氮源对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                2.2.1 对微生物蛋白含量的影响
                2.2.2 对微生物氮素周转的影响
                    2.2.2.1 对微生物氮素周转速率的影响
                    2.2.2.2 对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                        2.2.2.2.1 对原虫吞噬细菌量和吞噬速率的影响
                        2.2.2.2.2 对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                    2.2.2.3 细菌氮、原虫氮及微生物总氮之间周转速率的相关性分析
                    2.2.2.4 细菌氮、原虫氮与微生物总氮随时间动态变化的相关性分析
                2.2.3 对培养液中主要含氮物质组分的影响
                2.2.4 瘤胃内环境总氮与瘤胃内环境中各主要形式氮之间周转速率动态变化的相关性分析
            2.3 不同分子结构氮源对微生物活性的影响
                2.3.1 对原虫胞内蛋白酶和肽酶活性的影响
                2.3.2 对培养液主要纤维降解酶活性的影响
            2.4 不同分子结构氮源对微生物区系的影响
                2.4.1 对微生物区系比例的影响
                2.4.2 PCR-SSCP分析
            2.5 三种重要蛋白降解菌的定量分析
        3 讨论
            3.1 不同分子结构氮源对瘤胃发酵参数的影响
                3.1.1 对pH值的影响
                3.1.2 对氨氮浓度的影响
                3.1.3 对VFA浓度的影响
            3.2 不同分子结构氮源对微生物氮素周转的影响
            3.3 不同分子结构氮源对瘤胃内环境氮周转的影响
            3.4 不同分子结构氮源对培养液中纤维降解酶活性的影响
            3.5 不同分子结构氮源对三种主要的蛋白降解菌的影响
        4 小结
    第五章 不同单体氨基酸对瘤胃原虫与细菌之间的氮周转的影响
        引言
        1 材料与方法
            1.1 试验设计
            1.2 测定指标
                1.2.1 测定指标
                1.2.2 测定方法
                    1.2.2.1 尿素氮测定
                    1.2.2.2 滤纸纤维素酶活性
                    1.2.2.3 木聚糖酶活性
                    1.2.2.4 果胶酶活性
                    1.2.2.5 淀粉酶活性
        2 结果与分析
            2.1 不同单体氨基酸对发酵参数的影响
                2.1.1 不同单体氨基酸对培养液pH的影响
                2.1.2 不同单体氨基酸对培养液氨氮浓度的影响
                2.1.3 不同单体氨基酸对培养液挥发性脂肪酸(VFA)的影响
            2.2 不同单体氨基酸对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                2.2.1 对微生物蛋白含量的影响
                2.2.2 不同单体氨基酸对微生物氮素周转的影响
                    2.2.2.1 对细菌氮、原虫氮及微生物总氮周转速率的影响
                    2.2.2.2 不同单体氨基酸对原虫吞噬细菌量和吞噬速率的影响
                        2.2.2.2.2 不同单体氨基酸对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                    2.2.2.3 细菌氮、原虫氮及微生物总氮之间周转速率的相关性分析
                    2.2.2.4 细菌氮、原虫氮及微生物总氮随时间动态变化的相关性分析
                2.2.3 对培养液中主要含氮物质组分的影响
                2.2.4 瘤胃内环境总氮与瘤胃内环境中各主要形式氮之间周转速率动态变化的相关性分析
            2.3 不同单体氨基酸对微生物活性的影响
                2.3.1 对原虫胞内蛋白酶活性的影响
                2.3.2 对主要纤维酶活性的影响
            2.4 不同单体氨基酸对微生物区系的影响
                2.4.1 对微生物区系比例的影响
                2.4.2 PCR-SSCP分析
                    2.4.2.1 PCR扩增结果
                    2.4.2.2 SSCP多态性分析
            2.5 三种重要蛋白降解菌的定量分析
        3 讨论
            3.1 不同单体氨基酸对瘤胃瘤胃内环境发酵参数的影响
                3.1.1 对pH值的影响
                3.1.2 对氨氮浓度的影响
                3.1.3 对培养液VFA浓度的影响
            3.2 不同单体氨基酸对微生物氮素周转的影响
            3.3 不同单体氨基酸对瘤胃内环境氮素周转的影响
            3.4 不同单体氨基酸对微生物活性的影响
            3.5 不同单体氨基酸对主要蛋白降解菌的影响
        4 小结
    第六章 不同原虫控制剂对瘤胃微生物氮周转作用的影响
        引言
        1 材料与方法
            1.1 试验设计
            1.2 测定指标与方法
        2 结果与分析
            2.1 不同原虫控制剂对发酵参数的影响
            2.2 不同原虫控制剂对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                2.2.1 对微生物蛋白含量的影响
                2.2.2 对微生物氮素周转的影响
                    2.2.2.1 对细菌氮、原虫氮及微生物总氮周转速率的影响
                    2.2.2.2 对原虫吞噬细菌量和吞噬速率的影响
                    2.2.2.3 对原虫与细菌之间氮素周转的影响
                    2.2.2.4 细菌氮、原虫氮及微生物总氮之间氮周转速率的相关性分析
                2.2.3 对培养液中主要含氮物质组分的影响
                2.2.4 瘤胃内环境总氮与瘤胃内环境中各主要形式氮之间周转速率动态变化的相关性分析
            2.3 不同原虫控制剂对微生物区系的影响
                2.3.1 对微生物区系比例的影响
                2.3.2 PCR-SSCP分析
            2.4 三种重要蛋白降解菌的定量分析
        3 讨论
            3.1 不同原虫控制剂对瘤胃发酵参数的影响
                3.1.1 对pH值的影响
                3.1.2 对培养液氨氮浓度的影响
            3.2 不同原虫控制剂对微生物氮素周转的影响
            3.3 对瘤胃内环境氮素周转的影响
            3.4 对主要蛋白降解菌的影响
        4 小结
全文总论与研究展望
    1 全文讨论
        1.1 瘤胃原虫与细菌之间氮素周转研究方法探讨
            1.1.1 瘤胃原虫与细菌之间氮素周转研究方法的建立
            1.1.2 吞噬试验中瘤胃微生态的模拟
        1.2 瘤胃原虫与细菌之间氮素循环的规律
        1.3 瘤胃内环境氮素周转与微生物氮素周转的关系
        1.4 瘤胃微生物种群结构与微生物氮素周转的关系
        1.5 瘤胃原虫与细菌之间氮素周转的影响机制
    2 全文结论
    3 研究创新点
    4 研究展望
参考文献
致谢
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【参考文献】：
期刊论文
[1]反刍动物瘤胃内氨氮产生的微生物机制与调控手段[J]. 林波,王迪铭.  中国饲料. 2010(19)
[2]瘤胃发酵及其调控[J]. 张华琦.  饲料研究. 2008(06)
[3]用荧光染色法研究山羊瘤胃原虫对细菌吞噬速率的初报[J]. 王梦芝,王洪荣,李国祥,曹恒春,卢占军.  中国农业科学. 2008(05)
[4]混合瘤胃微生物体外利用蛋氨酸、赖氨酸的研究[J]. 刁欢,李吕木,胡良卫,凌俊.  中国草食动物. 2007(06)
[5]反刍动物瘤胃氮代谢研究进展[J]. 王文娟,汪水平,谭支良.  华中农业大学学报. 2007(05)
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硕士论文
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[2]饲粮结构与非结构碳水化合物比例与绵羊消化代谢及瘤胃代谢参数[D]. 吴秋珏.甘肃农业大学 2005
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本文编号：3415448