陕西省猪伪狂犬病调查及其病毒基因序列分析

发布时间：2017-05-03 07:16

  本文关键词：陕西省猪伪狂犬病调查及其病毒基因序列分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性传染病,最早在1813年于美国被发现,目前已广泛分布于全球50多个国家和地区。目前,欧洲一些国家通过采用基因缺失疫苗结合野毒株抗体ELISA检测方法,已控制或根除了猪伪狂犬病。我国大多数猪场也在广泛使用猪伪狂犬病基因缺失疫苗,使发病趋势从区域流行到散发流行,发病率有较大程度的降低。但近年来该病又有所抬头,潜伏感染的情况依然严重。为了解陕西省各地市规模化猪场中猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒感染情况,本研究对全省11个地市不同规模的免疫猪场不同批次的1240份血清样品用gE-ELISA抗体检测试剂盒进行了PRV野毒抗体检测。结果显示,陕西省各地市的PRV野毒抗体阳性率从0到46.44%不等;抗体平均阳性率为18.46%,猪场平均阳性率高达46.59%,各地市猪场阳性率从0到100%不等。2015年11月,陕西省汉中市某规模猪场出现仔猪发热、呕吐、腹泻等临床症状,同时伴有神经症状的出现:如四肢僵硬、肌肉震颤等。经药物治疗无效,出现以上症状2~3d后接连死亡,其病死率高达100%。剖检病死仔猪,主要病理变化表现为脑膜充血、淤血,肝脏边缘有坏死,肺脏充血、水肿等。根据临床症状及病理变化,初步诊断为猪伪狂犬病,随后我们采集病死猪的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、心脏等器官及脑组织、小肠内容物和血液等病料,通过PCR检测、病原分离、电镜负染观察以及动物接种试验,确诊为PRV野毒感染所致。通过对分离鉴定的陕西省汉中市PRV地方毒株HZ-2015株的g E、g B基因克隆,并对其毒力基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与国内外已分离鉴定的多株PRV进行同源性比较分析,绘制基因进化树,了解和掌握PRV HZ-2015株遗传变异状况,为陕西省猪伪狂犬病防控措施的制定提供了科学依据。
【关键词】：猪伪狂犬病 流行病学调查 病毒分离鉴定 聚合酶链反应 gE基因
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 文献综述11-19
• 第一章 猪伪狂犬病研究进展11-19
• 1.1 猪伪狂犬病的病原学11-15
• 1.1.1 伪狂犬病病毒概述11
• 1.1.2 伪狂犬病病毒的结构和生物分子学特性11-14
• 1.1.3 PRV的毒力基因及主要蛋白14-15
• 1.2 猪伪狂犬病的流行现状15-16
• 1.3 猪伪狂犬病的诊断方法16-17
• 1.3.1 PRV抗原检测方法16-17
• 1.3.2 PRV抗体检测方法17
• 1.4 猪伪狂犬病的防控措施17-19
• 1.4.1 疫苗免疫预防17-18
• 1.4.2 综合防控措施18-19
• 试验研究19-49
• 第二章 陕西省猪伪狂犬病血清流行病学调查及分析19-25
• 2.1 材料与方法19-21
• 2.1.1 血清样品19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 仪器与耗材19-20
• 2.1.4 血清样本的制备20
• 2.1.5 待检血清中PRV野毒抗体水平的检测20
• 2.1.6 结果判定20-21
• 2.2 结果21-22
• 2.2.1 陕西省不同市县送检血清的PRV野毒抗体阳性率21
• 2.2.2 不同年龄段猪群血清中PRV野毒抗体阳性率21-22
• 2.2.3 不同季节猪血清样品中PRV野毒抗体阳性率22
• 2.3 讨论22-23
• 2.4 小结23-25
• 第三章 猪伪狂犬病陕西HZ-2015株的分离与鉴定25-37
• 3.1 材料与方法25-26
• 3.1.1 病料来源25
• 3.1.2 病毒、细胞25
• 3.1.3 实验动物25
• 3.1.4 主要试剂25
• 3.1.5 主要仪器25-26
• 3.2 方法26-28
• 3.2.1 病理剖检及病料采集26
• 3.2.2 PRV基因组DNA的提取26
• 3.2.3 RT-PCR鉴定26-27
• 3.2.4 PK-15细胞的复苏27
• 3.2.5 细胞的传代培养27
• 3.2.6 病毒分离27
• 3.2.7 空斑纯化27-28
• 3.2.8 纯化病毒电镜负染观察28
• 3.2.9 PRV TCID_(50)的测定28
• 3.2.10 家兔感染试验28
• 3.3 结果28-35
• 3.3.1 病料检测结果28-30
• 3.3.2 病毒的分离30-31
• 3.3.3 病毒的空斑形态31-32
• 3.3.4 病毒粒子形态32-33
• 3.3.5 病毒滴度33
• 3.3.6 家兔感染试验33-35
• 3.4 讨论35-36
• 3.5 小结36-37
• 第四章 PRV HZ-2015株gE和gB基因的克隆及序列分析37-49
• 4.1 材料与方法37-42
• 4.1.1 病毒、菌株、细胞和质粒37
• 4.1.2 病料来源37
• 4.1.3 主要试剂37-38
• 4.1.4 病毒上清液DNA的提取38
• 4.1.5 引物的设计38
• 4.1.6 目的片段的扩增38
• 4.1.7 制胶与电泳38
• 4.1.8 PCR产物的纯化38-39
• 4.1.9 链接反应39
• 4.1.10 连接产物的转化39
• 4.1.11 质粒的提取39-40
• 4.1.12 重组质粒PCR鉴定40
• 4.1.13 重组质粒的测序与基因进化树的构建40-42
• 4.2 结果42-48
• 4.2.1 gE和gB基因的PCR扩增42
• 4.2.2 gE、gB基因阳性质粒的鉴定42
• 4.2.3 PRV HZ-2015分离株gE基因序列分析结果42-45
• 4.2.4 PRV HZ-2015分离株gB基因序列分析结果45-48
• 4.3 讨论48
• 4.4 小结48-49
• 结论49-50
• 参考文献50-57
• 致谢57-58
• 作者简介58

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