牛精原干细胞的分离培养和组蛋白H3K9三甲基化修饰研究

发布时间：2017-05-03 02:08

  本文关键词：牛精原干细胞的分离培养和组蛋白H3K9三甲基化修饰研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是哺乳动物体内唯一能持续批量更新并将基因传至子代的天然多能性成体干细胞,其在干细胞生物学和基础医学研究、畜牧业生产以及濒危动物保护等方面有广阔的应用前景。小型啮齿类和人SSCs的体外培养、鉴定及发育机制等方面的研究已取得显著进展,但有关大家畜特别是牛SSCs的研究仍存在很多问题,如取材不便、特异性标记有争议、培养体系不成熟、干细胞特性难以维持等。针对以上问题,本次研究首先对牛睾丸组织的冷冻保存、特导性分子标记筛选及分离富集方法进行了探究。结果显示,血清替代物(knockout serum replacer,KSR)可以替代胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)用于牛睾丸组织的冻存,组织复苏后结构完整、清晰;荧光定量PCR和免疫荧光染色结果表明,GFRα-1可以作为牛SSCs的标志物;制备牛睾丸生精上皮细胞悬液后,进行牛精原干细胞的富集,发现联合使用差异贴壁法和Percoll密度梯度离心法可以有效提升牛SSCs的富集度。本次实验进一步探讨了基于小分子抑制剂(2i)的培养体系对牛SSCs干性的维持效果。荧光定量PCR分析显示,2i培养条件能显著上调多能性基因(Oct4,Sox2,Nanog)、SSCs标记基因(Gfrα-1,Plzf)、抗凋亡基因(Bcl2)以及白血病抑制因子受体基因(LIFR)的表达,并抑制精原细胞分化标志基因(c-kit)和促凋亡基因(Bax)的表达,同时也提升了SSCs标志物PLZF蛋白的表达;细胞增殖活性检测结果显示2i培养条件对共培养体系中细胞(含SSCs)的增殖活性有轻度的抑制作用;使用双氧水诱导SSCs凋亡,发现添加2i可以有效抵御双氧水的凋亡刺激,显示2i培养条件具有抗凋亡的效果。以上结果说明2i培养条件有利于牛SSCs体外培养过程中干细胞特性的维持。有研究表明,组蛋白甲基化修饰与小鼠SSCs的多能性细胞的干细胞状态有密切关系。本实验初步探究了2i培养条件对牛SSCs组蛋白H3赖氨酸(K9)三甲基化修饰(H3K9me3)的影响。免疫荧光染色结果显示,2i培养条件能显著降低牛SSCs组蛋白H3K9me3修饰水平;荧光定量PCR进行检测结果表明2i培养条件也相应降低了Suv39h1/h2的表达。这提示,2i培养条件可能通过Suv39h1/h2介导牛SSCs的H3K9me3修饰。综上所述,本研究在冷冻保存牛睾丸组织,以及分离、富集和鉴定SSCs的基础之上,将2i培养条件用于牛SSCs的的体外培养,初步证实了小分子抑制剂2i在牛SSCs干性维持中的作用,及其对SSCs组蛋白H3K9me3表观修饰水平影响。本研究可以为从组蛋白甲基化表观修饰层面探究牛SSCs的干性维持机制奠定了基础。
【关键词】：牛 精原干细胞 分离 培养 组蛋白 H3K9三甲基化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩写词表10-11
• 前言11-13
• 第一篇 文献综述13-24
• 第1章 SSCs研究基础13-18
• 1.1 SSCs生物学特征13-14
• 1.2 SSCs分离和富集14-15
• 1.3 SSCs鉴定15-16
• 1.4 SSCs冷冻保存16-17
• 1.5 SSCs移植17-18
• 第2章 影响SSCs体外培养的因素18-21
• 2.1 基础培养基18-19
• 2.2 饲养层19
• 2.3 细胞因子19-21
• 第3章 干细胞与组蛋白甲基化修饰21-23
• 3.1 组蛋白甲基化21-22
• 3.2 组蛋白去甲基化22-23
• 第4章 总结与展望23-24
• 第二篇 研究内容24-61
• 第1章 成年牛SSCs的分离富集和冷冻保存24-39
• 1.1 材料与试剂24-27
• 1.2 实验方法27-31
• 1.3 实验结果31-36
• 1.4 讨论36-37
• 1.5 小结37-39
• 第2章 2i条件对牛SSCs体外培养过程中细胞特性的影响39-56
• 2.1 材料与试剂39-41
• 2.2 实验方法41-47
• 2.3 实验结果47-53
• 2.4 讨论53-55
• 2.5 小结55-56
• 第3章 2i培养条件对牛SSCs组蛋白H3K9me3的影响56-61
• 3.1 材料与试剂56-57
• 3.2 实验方法57-58
• 3.3 实验结果58-60
• 3.4 讨论60
• 3.5 小结60-61
• 结论61-62
• 参考文献62-74
• 附录74-76
• 攻读硕士期间发表的学术论文76-77
• 导师简介77-78
• 作者简介78-79
• 致谢79

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