抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的放线菌筛选及其作用机制研究

发布时间：2017-05-03 16:00

  本文关键词：抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的放线菌筛选及其作用机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在奶牛养殖生产实践中,表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,S.epidermidis)是引起奶牛隐性乳房炎的重要条件致病菌之一。由表皮葡萄球菌及其他凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphylococci,CNS)形成的生物膜结构,能够增强致病菌在乳腺上皮细胞表面的黏附定植能力,促使致病菌不断向外界释放毒力因子。生物膜为膜内致病菌提供保护屏障,阻碍药物与细胞作用靶点结合,最终造成了奶牛乳房炎反复发作难以治愈的现状。因此,新型生物膜抑制剂的研发逐渐成为预防兽医领域的研究热点。放线菌能够产生丰富的代谢产物,是挖掘生物活性物质的天然宝库。从放线菌中分离获得新型生物膜抑制剂,在奶牛乳房炎的防治及新药研发中具有重大应用价值。本论文以分离自新疆南疆盐碱地区土壤的185株放线菌为研究对象,采用微量板半定量法筛选获得3株具有抑制表皮葡萄球菌5-121-2及ATCC 35984生物膜形成的活性菌株,分别是拟诺卡氏菌属(TRM46200),链霉菌属(TRM41337)和糖单孢菌属(TRM46814)。采用显微镜观察经3株放线菌发酵液处理后的表皮葡萄球菌生物膜在固相载体表面附着能力的明显下降,发现经蛋白酶K及加热处理后,发酵液抑制生物膜活性明显减弱或丧失。采用硫酸铵沉淀法获得放线菌发酵液粗蛋白,并对其进行相关抑制生物膜形成活性测定。采用细菌黏附碳氢化合物法(Bacterial Adhesion to Hydrocarbon,BATH)检测经3株放线菌发酵液蛋白处理前后2株表皮葡萄球菌细胞表面疏水性(Cell Surface Hydrophobicity,CSH)明显降低,而细胞表面疏水性介导了胞间黏附,一旦细胞表面疏水性降低,将会影响致病菌与致病菌、致病菌与宿主之间的非特异性黏附,从而导致生物膜形成受阻。3株放线菌发酵液蛋白的抑制活性在细菌生物膜形成的初始黏附时期及聚集时期均发挥着明显的作用。采用高碘酸钠、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶K和DNase I分别处理表皮葡萄球菌5-121-2及ATCC 35984生物膜。结果表明高碘酸钠能够有效地破坏表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜结构,而其他处理组对其作用效果不明显,说明其生物膜主要由还原性胞外多糖组成。表皮葡萄球菌5-121-2经α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶K和DNase I处理后,生物膜结构被破坏,而高碘酸钠对其作用效果不明显,说明表皮葡萄球菌5-121-2生物膜中非还原性胞外多糖、胞外蛋白及胞外DNA同时参与其生物膜结构的组成。采用琼脂糖凝胶电泳和柱前衍生高效液相色谱法分别检测经3株放线菌发酵液蛋白处理后2株表皮葡萄球菌生物膜内胞外DNA及胞外多糖变化情况。发现经处理后的表皮葡萄球菌的胞外多糖单糖组分种类及相对摩尔比例均发生改变,胞外DNA均被降解。说明放线菌发酵液蛋白主要通过改变细菌生物膜成分,而实现其生物学活性。最后,分别检测2株表皮葡萄球菌对青霉素、链霉素和土霉素敏感性。结果表明,标准菌株ATCC35984和临床菌株5-121-2对链霉素表现一定的耐受性,说明生物膜在某种程度上增加了致病菌对抗生素的耐药性。采用棋盘法检测放线菌发酵液蛋白与链霉素体外联合抑制表皮葡萄球菌的效果,结果表明,获得的协同作用效果最明显组合中,抗生素与发酵液蛋白联用时的有效使用剂量均明显低于单独使用剂量。说明发酵液蛋白抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的同时,提高了对抗生素的敏感性。本研究目的在于充分利用新疆丰富的放线菌资源,筛选出放线菌源无毒、高效抑制生物膜的活性物质,并研究其对引起奶牛隐性乳房炎的表皮葡萄球菌生物膜形成机制造成的影响,为表皮葡萄球菌生物膜感染相关疾病的防治提供实验依据。
【关键词】：奶牛乳房炎 表皮葡萄球菌 生物膜 放线菌 发酵液蛋白
【学位授予单位】：塔里木大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 文献综述11-20
• 1.1 表皮葡萄球菌生物膜与感染相关研究进展11-14
• 1.2 表皮葡萄球菌生物膜与细菌耐药性相关研究进展14-15
• 1.3 表皮葡萄球菌生物膜防治相关研究进展15-19
• 1.4 论文设计思路19-20
• 1.4.1 研究目的及意义19
• 1.4.2 技术路线19-20
• 第2章 抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的放线菌筛选20-28
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 实验菌株20-21
• 2.1.2 培养基21
• 2.1.3 实验仪器21
• 2.2 方法21-23
• 2.2.1 放线菌菌株活化及发酵21-22
• 2.2.2 放线菌发酵液对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响22
• 2.2.3 放线菌发酵液对表皮葡萄球菌生物膜结构的影响22
• 2.2.4 放线菌发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成活性稳定性分析22-23
• 2.3 结果与分析23-26
• 2.3.1 具有抑制生物膜形成活性的放线菌筛选23-24
• 2.3.2 放线菌对表皮葡萄球菌生物膜结构影响24-25
• 2.3.3 放线菌发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成活性稳定性分析25-26
• 2.4 讨论26-28
• 第3章 抑制表皮葡萄球菌生物膜形成放线菌发酵液蛋白的分离及活性检测28-43
• 3.1 材料28-29
• 3.1.1 实验菌株28-29
• 3.1.2 培养基及溶液29
• 3.1.3 实验仪器29
• 3.2 方法29-33
• 3.2.1 放线菌菌株活化及发酵29
• 3.2.2 放线菌发酵液蛋白的提取29-30
• 3.2.3 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响30
• 3.2.4 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌生物膜形成不同阶段的影响30
• 3.2.5 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌细胞表面疏水性的影响30-31
• 3.2.6 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌胞外DNA的影响31
• 3.2.7 表皮葡萄球菌 51212 及ATCC 35984生物膜形成依赖型检测31-32
• 3.2.8 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌胞外多糖的影响32-33
• 3.3 结果与分析33-40
• 3.3.1 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响33-34
• 3.3.2 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌生物膜不同形成阶段的影响34-35
• 3.3.3 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌细胞表面疏水性的影响35-36
• 3.3.4 表皮葡萄球菌 51212 及ATCC 35984生物膜形成依赖型检测36-37
• 3.3.5 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌胞外DNA的影响37-38
• 3.3.6 放线菌发酵液蛋白对表皮葡萄球菌胞外多糖的影响38-40
• 3.4 讨论40-43
• 第4章 放线菌发酵液蛋白与抗生素药物体外联合作用表皮葡萄球菌的抑菌活性研究43-51
• 4.1 材料43
• 4.1.1 实验菌株43
• 4.1.2 主要试验试剂43
• 4.1.3 实验仪器43
• 4.2 方法43-45
• 4.2.1 抗生素作用表皮葡萄球菌最低抑菌浓度测定43-44
• 4.2.2 放线菌发酵液蛋白与抗生素药物体外联合作用表皮葡萄球菌的抑菌效果测定44-45
• 4.2.3 放线菌发酵液蛋白与抗生素药物体外联合作用表皮葡萄球菌的抑菌效果评价45
• 4.3 结果与分析45-50
• 4.3.1 抗生素作用表皮葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）测定45-46
• 4.3.2 放线菌发酵液蛋白与抗生素药物体外联合作用表皮葡萄球菌的抑菌效果评价46-50
• 4.4 讨论50-51
• 第5章 总结与展望51-53
• 参考文献53-58
• 致谢58-59
• 作者简介59-60
• 附录60-63

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本文编号：343275