三种动物源隐孢子虫种类的分子鉴定与亚型分析

发布时间：2017-05-03 18:15

  本文关键词：三种动物源隐孢子虫种类的分子鉴定与亚型分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：隐孢子虫是一种具有重要医学和兽医学意义的原生动物寄生虫,可感染包括人在内的绝大多数动物。野生动物和牛均是隐孢子虫的重要储存宿主,目前研究人员已在多种野生动物中发现了不同隐孢子虫虫种/亚型,且某些地区野生动物源与牛源隐孢子虫存在交叉感染,甚至具人兽共患性。因此,为了探寻四川省某些野生动物源隐孢子虫与牛源隐孢子虫虫种/亚型间的关系,进行了本研究。本试验收集了2014年4月-2015年8月期间采自四川黑熊、藏酋猴、羚牛和猕猴养殖场,成都、碧峰峡动物园,成都、雅安大熊猫繁育基地的圈养野生动物粪便样品共计465份,采用饱和蔗糖漂浮和巢式PCR法对其中隐孢子虫的感染情况进行了检测和鉴定,同样利用巢式PCR法鉴定本实验室保存的四川地区牛源隐孢子虫阳性粪便样品53份；扩增GP60及MLST位点(MS1、MS2、MS3、MS16)基因鉴定隐孢子虫亚型。并运用Structure分析了Cryptosporidium andersoni的种群结构,探索四川地区C. andersoni的种群特征。粪便漂浮后镜检结果显示野生动物感染隐孢子虫为阴性。但巢式PCR检测到了松鼠猴源、骆驼源隐孢子虫(SCSM01、CDBC01)各1份。同时有48株牛源隐孢子虫分离株(SC01-SC48)的18S rRNA基因位点成功扩增。结合18S rRNA基因位点序列同源性和种系发育分析判断SCSM01为C. hominis, CDBC01为C. andersoni 。而SC01-SC07、SC08-SC15、SC16-SC29和SC30-SC48分别为C. parvum、C.ryanae、C. andersoni和C. bovis。四川地区的牛源隐孢子虫的优势虫种为C. bovis。且分离株SC20-SC29与CDBCO1的18S rRNA基因位点无碱基的差异,而SC16-SC19与CDBCO1仅在431位显示一个碱基序列差异,四川省野生动物与牛隐孢子虫可能存在交叉感染。SCSMO1与SCO1-SC07的GP60基因位点序列的种系发育表明,SCSM01为新亚型,命名为IkA7G4；而SC01-SC07亚型为IIdA19G1。CDBC01和SC16-SC29的MS1、MS2、MS3和MS16四个微卫星位点(MLST)的序列种系发育则表明,CDBCO1的亚型为A6、A5、A2、A1,SC16-SC24亚型为A4、A4、A2、A1；SC25-SC28亚型为A4、A4、A4、A1；SC29亚型为A1、A4、A4、A1。将我国所有的C.andersoni亚型进行种群结构分析,共得到了3个族群,各族群均有本试验所得亚型,且优势亚型分布在第1族群,与第2族群中的亚型相比具有一定的区域特异性。综上所述,本试验首次在四川地区检测到了松鼠猴感染隐孢子虫,弥补了松鼠猴感染了隐孢子虫的空白,丰富了关于非人灵长类的宿主范围,鉴定出的IkA7G4填充了C. hominis的亚型数据库。再次鉴定出骆驼源C. andersoni预示着C. andersoni可能为四川省感染骆驼的优势虫种。同时鉴定出四川地区牛与骆驼均可感染C.andersoni,验证了四川地区的牛与野生反刍动物之间的隐孢子虫可能存在交叉感染的推测。首次在四川地区检测到牛源C. parvum并鉴定亚型,确定了四川地区牛源隐孢子虫的优势虫种为C. bovis,为牛隐孢子虫病的预防提供了基础数据。分析了四川地区C. andersoni亚型种群结构,确定了四川地区的C. andersoni存在独特的种群特征。
【关键词】：隐孢子虫 松鼠猴 骆驼 牛 18S rRNA GP60 MLST
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.723
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文献综述12-25
• 1 隐孢子虫简介12-14
• 2 隐孢子虫分类14-16
• 3 隐孢子虫的分子鉴定16-20
• 4 松鼠猴和骆驼源隐孢子虫研究现状20-22
• 5 牛源隐孢子虫研究现状22-24
• 6 目的与意义24-25
• 第二章 松鼠猴源、骆驼源隐孢子虫的虫种鉴定25-37
• 1 材料和方法25-31
• 1.1 主要仪器和试剂25-26
• 1.2 粪便样品采集26-28
• 1.3 样品处理28-29
• 1.3.1 粪便隐孢子虫卵囊镜检28
• 1.3.2 卵囊样品的回收28
• 1.3.3 粪便DNA提取28-29
• 1.4 PCR扩增29-31
• 1.4.1 PCR引物的设计与反应29-31
• 1.4.2 PCR产物检测31
• 1.4.3 PCR产物测序31
• 1.5 测序结果分析31
• 1.5.1 相关序列搜索与下载31
• 1.5.2 同源性分析31
• 1.5.3 种系发育分析31
• 2 结果31-35
• 2.1 镜检结果31
• 2.2 PCR扩增结果31-32
• 2.3 测序结果32
• 2.4 同源性分析32-33
• 2.5 种系发育分析33-35
• 3 讨论35-37
• 3.1 松鼠猴源隐孢子虫35
• 3.2 骆驼源隐孢子虫35-37
• 第三章 牛源隐孢子虫的虫种鉴定37-46
• 1 材料和方法37-38
• 1.1 主要仪器和试剂37
• 1.2 粪便样品37
• 1.3 样品处理37-38
• 1.3.1 清洗样品37
• 1.3.2 DNA提取37-38
• 1.4 PCR扩增38
• 1.4.1 PCR引物的设计与反应38
• 1.4.2 PCR产物检测38
• 1.4.3 PCR产物测序38
• 1.5 测序结果分析38
• 1.5.1 相关序列搜索与下载38
• 1.5.2 同源性分析38
• 1.5.3 种系发育分析38
• 2 结果38-42
• 2.1 PCR扩增结果38-39
• 2.2 测序结果39
• 2.3 同源性分析39-40
• 2.4 种系发育分析40-42
• 2.5 不同年龄段牛感染隐孢子虫种类42
• 3 讨论42-44
• 3.1 牛源C.parvum42-43
• 3.2 牛源C.ryanae43
• 3.3 牛源C.andersoni43-44
• 3.4 牛源C.bovis44
• 4 小结44-46
• 第四章 隐孢子虫的亚型鉴定与分析46-59
• 1 材料和方法46-48
• 1.1 主要仪器和试剂46
• 1.2 样品46
• 1.3 PCR扩增46-48
• 1.3.1 PCR引物的设计与反应46-48
• 1.3.2 PCR产物检测48
• 1.3.3 PCR产物测序48
• 1.4 测序结果分析48
• 1.4.1 相关序列搜索与下载48
• 1.4.2 种系发育分析48
• 1.5 C.andersoni种群特征分析48
• 2 结果48-56
• 2.1 PCR扩增结果48-50
• 2.1.1 GP60位点扩增结果48-50
• 2.1.2 MS1、MS2、MS3和MS16扩增结果50
• 2.2 测序结果50-51
• 2.3 种系发育分析51-55
• 2.3.1 GP60种系发育分析51-52
• 2.3.2 MS1、MS2、MS3和MS16种系发育分析52-55
• 2.4 C.andersoni种群结构分析55-56
• 3 讨论56-59
• 3.1 GP60亚型56-57
• 3.1.1 SCSM01的亚型56
• 3.1.2 SC01-SC07的亚型56-57
• 3.2 MLST亚型57-58
• 3.3 C.andersoni种群特征58-59
• 结论59-60
• 参考文献60-70
• 致谢70-72
• 附录72-79
• 攻读学位期间发表的学术论文79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 张冰;张杰;许杰;何惠君;巴图艾德尼;;隐孢子虫检测方法研究进展[J];中国草食动物科学;2014年02期

2 高云霞;黄君礼;吴明松;李绍峰;;隐孢子虫检测方法[J];化学工程师;2008年04期

3 张龙现,蒋金书,刘群,宁长申,朱引洁,吴绍强;巢式PCR检测隐孢子虫卵囊的研究[J];畜牧兽医学报;2003年05期

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本文编号：343523