兔源干酪乳杆菌对仔兔小肠潘氏细胞分泌功能的影响

发布时间：2017-05-04 05:11

  本文关键词：兔源干酪乳杆菌对仔兔小肠潘氏细胞分泌功能的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：断奶仔兔容易发生肠道疾病,鉴于使用抗生素的弊端,利用益生菌等抗生素替代品将是必然趋势。乳酸菌是猪、鸡等单胃动物的主要益生菌,但并不是家兔肠道中的优势菌,其是否可以被开发为家兔的益生菌还有待研究。益生菌对动物的作用包括消化营养物质、促进肠道发育和调节肠道微生物区系等。其中,益生菌调节微生物区系的方式之一是通过宿主肠细胞内Toll样受体与宿主产生信号交流,促进宿主感知肠道菌群数量及结构,并通过激活先天与后天免疫进行调控。本试验旨在分离仔兔肠道乳酸杆菌和小肠潘氏细胞的基础上,检测乳酸杆菌对仔兔潘氏细胞分泌功能及肠道免疫的影响;并通过检测乳酸杆菌基因组DNA对潘氏细胞TLR 9受体表达水平及炎性反应的影响来探讨其益生效应,为开发家兔益生菌提供理论依据。本研究利用选择性培养基分离兔源乳酸杆菌;给7日龄新西兰白兔灌服所分离的干酪乳杆菌8d后,检测其对仔兔肠道发育水平以及十二指肠、空肠和回肠组织中TLR 9受体、溶菌酶及α-防御素基因表达水平的影响;以原代分离的小肠隐窝为试验材料,用未酶切及酶切处理的干酪乳杆菌基因组DNA分别免疫刺激家兔的隐窝细胞,检测基因组DNA对隐窝中潘氏细胞TLR 9受体、溶菌酶、α-防御素、TNF-α、INF-β和IL-6基因表达水平的影响。试验结果如下:1)用选择性培养基结合特异引物PCR及16S rDNA序列测序方法分离鉴定出兔源酸鱼乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌和屎肠球菌,其中干酪乳杆菌GC含量最高,被选作受试菌种;2)采用改进的EDTA螯合法分离隐窝细胞,不同螯合条件下分离效果差异显著(P0.05),本试验选择低温、10 mmol/L EDTA为最佳分离条件,得到的绒毛和隐窝形态完整,基因组DNA与总RNA未发生降解。分离的隐窝富集物中溶菌酶和α-防御素基因相对表达水平极显著高于绒毛(P0.01);3)人工哺乳仔兔灌服干酪乳杆菌菌液,可极显著提高小肠总菌中乳酸杆菌的比例(P0.01),降低大肠杆菌的比例(P0.01);显著提高仔兔十二指肠、空肠组织中TLR 9、溶菌酶及α-防御素基因的表达水平(P0.05),但对所检测的回肠各基因表达水平没有显著影响(P0.05);能极显著提高十二指肠和空肠中脱颗粒潘氏细胞所占的比例(P0.01),但对回肠没有影响;4)未经酶切处理的干酪乳杆菌基因组DNA对培养的肠隐窝细胞并没有显著的免疫刺激功能(P0.05);5)肠隐窝细胞可以接受CpG 2007的免疫刺激,CpG 2007极显著地提高隐窝TLR 9受体、溶菌酶、α-防御素、TNF-α、INF-β和IL-6基因的表达水平(P0.01);干酪乳杆菌基因组DNA经过Sau3AI酶切之后,可对隐窝产生免疫刺激作用,并显著地提高肠隐窝细胞TLR 9及α-防御素的基因表达水平(P0.05),但对溶菌酶、TNF-α、INF-β和IL-6基因的表达没有显著影响。综上所述,干酪乳杆菌可以提高哺乳仔兔肠道固有免疫水平,宿主细胞可以识别来源于细菌基因组的小片段核酸序列,激活固有免疫反应相关信号通路,提高肠道抗菌能力,为合理运用乳酸菌提供一定的理论依据。
【关键词】：家兔 干酪乳杆菌 TLR 9受体 潘氏细胞 非甲基化CpG ODN
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S829.1
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文献综述13-21
• 1.1 前言13
• 1.2 家兔肠道菌群结构与功能13-15
• 1.2.1 家兔肠道菌群结构特点13-14
• 1.2.2 家兔肠道菌群的功能14-15
• 1.3 乳酸杆菌15
• 1.3.1 乳酸杆菌的分类15
• 1.3.2 乳酸杆菌的免疫功能15
• 1.4 潘氏细胞15-18
• 1.4.1 潘氏细胞能合成和分泌多种抗菌物质16-17
• 1.4.2 潘氏细胞的分泌物对肠道微生物区系的影响17
• 1.4.3 潘氏细胞的防御素对先天免疫的调节17-18
• 1.5 TOLL样受体与非甲基化CPG DNA18-20
• 1.5.1 Toll样受体分类及基本结构18-19
• 1.5.2 TLR 9 与非甲基化CpG DNA19-20
• 1.6 研究内容与技术路线20-21
• 1.6.1 主要研究内容20
• 1.6.2 技术路线20-21
• 第二章 兔源干酪乳杆菌的分离鉴定及其对哺乳仔兔潘氏细胞分泌功能的影响21-35
• 2.1 前言21-22
• 2.2 材料与方法22-25
• 2.2.1 乳酸杆菌的分离培养22
• 2.2.2 菌落鉴定与保存22-23
• 2.2.3 动物试验23
• 2.2.4 动物试验指标测定方法23-24
• 2.2.5 数据分析24-25
• 2.3 试验结果25-31
• 2.3.1 分离培养得到乳酸菌菌株25-27
• 2.3.2 灌服干酪乳杆菌对哺乳仔兔胃、盲肠pH和肠道微生物的影响27
• 2.3.3 灌服干酪乳杆菌对哺乳仔兔肠道形态结构的影响27-28
• 2.3.4 灌服干酪乳杆菌对哺乳仔兔肠道潘氏细胞数量的影响28-29
• 2.3.5 灌服干酪乳杆菌对肠组织TLR 9、DEFEN、LYZ基因表达的影响29-30
• 2.3.6 灌服干酪乳杆菌对肠组织炎性因子基因表达的影响30-31
• 2.4 讨论31-34
• 2.4.1 乳酸杆菌的分离培养与鉴定31-32
• 2.4.2 干酪乳杆菌对仔兔肠道微生物、形态结构及相关基因表达水平的影响32-34
• 2.5 小结34-35
• 第三章 低温螯合法分离家兔小肠绒毛和隐窝及分离效果鉴定35-43
• 3.1 前言35
• 3.2 材料与方法35-37
• 3.2.1 试验设计与螯合剂的配制35-36
• 3.2.2 小肠绒毛和隐窝的洗脱分离36
• 3.2.3 绒毛与隐窝细胞富集量、绒毛相对完整率与隐窝细胞相对活率测定36
• 3.2.4 DNA与RNA提取和电泳36
• 3.2.5 隐窝细胞的培养36-37
• 3.2.6 数据统计分析37
• 3.3 结果与分析37-41
• 3.3.1 绒毛和隐窝细胞团的形态和纯度37-38
• 3.3.2 各分离条件对绒毛富集率与绒毛相对完整率的影响38
• 3.3.3 各分离条件对隐窝富集率与隐窝细胞相对活率的影响38-39
• 3.3.4 绒毛和隐窝细胞DNA、总RNA保存完整39-40
• 3.3.5 绒毛和隐窝细胞团差异表达基因检测40
• 3.3.6 隐窝细胞在培养过程中相关基因表达量变化40-41
• 3.4 讨论41-42
• 3.5 结论42-43
• 第四章 干酪乳杆菌基因组DNA对原代分离培养的兔小肠隐窝细胞分泌功能的影响43-54
• 4.1 前言43
• 4.2 试验设计与方法43-45
• 4.2.1 试验设计43-44
• 4.2.2 试验方法44-45
• 4.3 试验结果45-50
• 4.3.1 干酪乳杆菌基因组DNA对仔兔小肠隐窝细胞的影响45-47
• 4.3.2 酶切基因组序列与非甲基化CpG ODN对仔兔小肠隐窝细胞的影响47-48
• 4.3.3 酶切基因组序列与非甲基化CpG ODN对炎性因子表达的影响48-50
• 4.4 讨论50-53
• 4.4.1 基因组DNA与酶切核酸序列对隐窝细胞TLR 9 受体表达的影响50-52
• 4.4.2 基因组DNA与酶切核酸序列对隐窝细胞炎性因子表达的影响52-53
• 4.5 小结53-54
• 第五章 总体结论与创新点54-55
• 5.1 总体结论54
• 5.2 创新点54
• 5.3 有待进一步研究的问题54-55
• 参考文献55-62
• 附录62-63
• 致谢63-64
• 作者简介64

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