单增李斯特菌Dsb-like蛋白Lmo1059的功能研究

发布时间：2021-10-16 05:51

　　单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）为革兰氏阳性胞内食源性病原菌，可突破宿主的消化道屏障、血脑屏障和胎盘屏障，在细胞内存活并增殖。因此，在消化道和宿主细胞内，李斯特菌将面临各种氧化应激。那么，李斯特菌如何在氧化应激条件下维持细胞内的二硫键稳态的呢？为此，我们对含有CxxC基序的二硫键形成相关蛋白（Disulfide bond forming protein, Dsb）Lmo1059的功能进行了研究。通过大肠杆菌原核表达系统，我们成功表达并纯化了Lmo1059蛋白，且为可溶性形式。通过DTT作为底物的二硫键异构酶活性分析表明: Lmo1059具有较高的异构酶活性，其二硫键异构酶催化活性的米氏常数Km为22.94mM。以胰岛素为底物的二硫键还原酶活性分析表明：Lmo1059基本无二硫键还原酶活性。为了进一步研究Lmo1059的生物学功能，我们构建了单增李斯特菌lmo1059突变株。过氧化氢应激实验表明：与野生株相比，lmo1059缺失株在体外培养条件下对H2O2敏感性无显著差异，这说明Lmo1059蛋白可能并没有直接参与H2O2应激相关的蛋白修复。李... 

【文章来源】：浙江农林大学浙江省

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

同源重组敲除基因示意图

图 2.质粒 pKSV7 图谱Figure 2. The map of plasmd pKSV7.的酶切和回收拷贝质粒，选用BaｍHＩ和HindIII两个10 μl（200 ng/μl）2 μl切酶（10 U/μl） 各 0.5 μl20 μl使用 DNA 回收试剂盒回收酶切片段，通 PCR 和 PCR 产物回收m EGDe 基因序列设计基因的上下游同表 1 lmo1059 基因敲除引物

30 ℃培养 2 天。挑取单菌落按上述方法进行传代筛选缺失株，基因缺失 PCR 鉴定后备份保存在-80 ℃，40%甘油。.6 回补载体的克隆与基因回补株构建.6.1 构建基因回补的重组质粒质粒 pIMK2 和 pIMK4 是用于 Lm 的基因回补载体，pIMK2 是整合型回补而 pIMK4 是诱导型回补载体。图谱如图 3(A，B)，选择酶切位点 NcoHI 克隆重组质粒，方法流程同上述。根据 lmo1059 的完整编码框设计引表 2 lmo1059 基因回补引物Table 2 Gene complement primer for lmo1059 mutant物bA EGD fwd：TTTCCATGGATATTAGTCAAATTAAAGCAGAbA EGD rev：TCTGGATCCTTATTTAGCTAATTCATCATCAAGTAGCA B

【参考文献】：
期刊论文
[1]大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立[J]. 杨坤,巩振辉,李大伟.  北方园艺. 2010(14)



本文编号：3439272