羊口疮病毒的分离鉴定及B2L囊膜蛋白单克隆抗体的制备
发布时间：2021-10-20 16:38
羊传染性脓疱病（Orf）由羊口疮病毒（Orf Virus，ORFV）引起，是世界范围内危害养羊业发展的人畜共患疾病之一。ORFV不仅能引起小型反刍动物和部分野生动物感染，还可能污染环境，造成与受污染环境密切接触的人员感染发病。目前，一般采用ORFV灭活苗或弱毒苗接种，但效果并不理想，有时会出现免疫羊感染ORFV的情况。由于细胞免疫应答是ORFV引起宿主的主要免疫类型，因此，研制T细胞表位和B细胞表位组合的多表位基因工程疫苗，能够强化细胞免疫途径以及激活高效的体液免疫应答途径，对Orf的防控将有重要的应用价值。本研究在黑龙江大庆地区发现Orf疑似病例，通过病原分离、病毒形态学观察、间接免疫荧光检测（IFA）、DNA序列和氨基酸序列比对、家兔和小鼠的感染试验以及回归动物试验等，最终确定获得一株ORFV，命名为OV/HLJ/04。流行株之间遗传关系分析证明OV/HLJ/04与2011年山西株（HQ221964）之间遗传关系密切。此外，基于B2L基因的系统发育进化树表明OV/HLJ/04应当归类于基因Ⅲ型ORFV。继而，本研究选择ORFV的囊膜蛋白B2L基因为靶基因，构建原核表达载体，将表达产...
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
CONTENTS
英文缩略表
第一章 文章综述
1.1 引言
1.2 羊口疮病毒研究进展
1.2.1 病原学及其分类
1.2.2 病毒的形态结构
1.2.3 病毒的基因组结构
1.2.4 毒力因子
1.2.5 ORFV 的研究展望
1.3 蛋白 B2L 的研究进展
1.4 表位研究方法
1.5 目的与意义
第二章 羊口疮病毒的分离鉴定
2.1 材料
2.1.1 病料来源、细胞和实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要器材
2.2 方法
2.2.1 病毒分离
2.2.2 分离株的鉴定
2.2.2.1 电镜观察
2.2.2.2 间接免疫荧光检测（IFA）
2.2.2.3 PCR 鉴定
2.2.2.4 TCID50 测定
2.2.2.5 家兔小鼠的攻毒实验
2.2.2.6 动物回归试验
2.3 结果
2.3.1 病原体电镜观察结果
2.3.2 间接免疫荧光检测（IFA）
2.3.3 TCID50 测定
2.3.4 家兔小鼠的攻毒实验
2.3.5 回归实验
2.3.6 B2L 和 F1L 基因鉴定及进化分析结果
第三章 单克隆抗体的制备
3.1 材料
3.1.1 细胞、细菌和实验动物
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器设备和耗材
3.2 方法
3.2.1 蛋白 B2L 的表达与纯化
3.2.2 免疫小鼠
3.2.3 间接 ELISA 方法检测抗体效价
3.2.4 杂交瘤细胞株的建立
3.2.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选
3.2.6 阳性杂交瘤细胞的克隆化
3.2.7 杂交瘤细胞的冻存和复苏
3.2.8 单克隆抗体的大量制备及初步纯化
3.2.9 杂交瘤细胞培养上清及初步纯化单抗 4E2 的效价测定
3.2.10 4E2 的纯化及浓度的测定
3.2.11 2E4 生物学活性鉴定
3.3 结果
3.3.1 蛋白 B2L 的诱导表达、纯化结果
3.3.2 抗原和血清最佳工作浓度的确立
3.3.3 小鼠免疫血清抗体效价检测
3.3.4 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选
3.3.5 单抗的大量制备及初步纯化
3.3.6 2E4 效价的测定
3.3.7 2E4 特异性鉴定
第四章 中和试验和免疫荧光实验
4.1 材料
4.1.1 毒株、细胞和动物
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 2E4 的中和试验
4.2.2 间接免疫荧光实验
4.3 结果
4.3.1 中和试验
4.3.2 免疫荧光检测 ORFV 在感染细胞内的分布情况
第五章 讨论
5.1 羊口疮病毒的分离鉴定
5.2 单克隆抗体的制备
5.3 中和试验和免疫荧光实验
第六章 结论
参考文献
致谢
附录
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]羊口疮病毒黑龙江省分离株的分离鉴定[J]. 于永忠,谭强,赵文博,包凯,崔玉东. 中国预防兽医学报. 2013(08)
[2]羊胚胎鼻甲细胞的原代培养及其在羊口疮病毒研究中的应用[J]. 汪园园,童双,李威,高丰,宁章勇,罗树红. 中国兽医科学. 2013(05)
[3]新疆羊口疮病毒分离鉴定及B2L基因分析与表达[J]. 李瑞芳,李国华,孟仁,乔军,张辉,陈创夫. 中国预防兽医学报. 2013(03)
[4]羊口疮病毒分子生物学的研究进展[J]. 闫丰超,邵佳,窦永喜. 中国兽医科学. 2013(01)
[5]羊口疮病毒农安分离株的分离鉴定及Orf059（F1L）基因的序列分析[J]. 苏高莉,赵魁,孙秀萍,何叶,周平,潘伟,包英夫,李吉达,宋德光,高丰. 中国兽医学报. 2013(01)
[6]湖北省羊口疮病毒的分离鉴定[J]. 王光祥,尚佑军,陈江涛,吕占禄,张克山,刘湘涛. 动物医学进展. 2012(11)
[7]羊口疮病毒B2L蛋白二级结构及其细胞表位的预测[J]. 王光祥,尚佑军,吕占禄,田宏,张克山,刘湘涛. 中国兽医科学. 2012(11)
[8]羊口疮病毒分子特征与免疫逃逸策略[J]. 于永忠,吴志军,朱战波,潘求真,崔玉东. 病毒学报. 2012(03)
[9]贵州地区羊口疮病毒B2L基因克隆及原核表达载体构建[J]. 向智龙,卓建华,程振涛,欧德渊,鲜思美,尹传宝,黄璐,禾彩红. 中国畜牧兽医. 2011(07)
[10]抗原表位研究方法进展[J]. 宋帅,李春玲,贾爱卿,杨冬霞,李淼. 动物医学进展. 2010(12)
博士论文
[1]羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究[D]. 赵魁.吉林大学 2010
硕士论文
[1]抗S.aureus TRAP蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析[D]. 周雪.黑龙江八一农垦大学 2012
[2]羊传染性脓疱病毒感染羔羊细胞免疫应答变化规律的研究[D]. 张冰冰.吉林大学 2011
[3]蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备[D]. 李文超.华中农业大学 2007
[4]羊传染性脓疱病毒生物学特性及PCR检测方法的研究[D]. 罗云.内蒙古农业大学 2006
[5]抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及应用研究[D]. 曹亮.新疆农业大学 2005
本文编号：3447249
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
CONTENTS
英文缩略表
第一章 文章综述
1.1 引言
1.2 羊口疮病毒研究进展
1.2.1 病原学及其分类
1.2.2 病毒的形态结构
1.2.3 病毒的基因组结构
1.2.4 毒力因子
1.2.5 ORFV 的研究展望
1.3 蛋白 B2L 的研究进展
1.4 表位研究方法
1.5 目的与意义
第二章 羊口疮病毒的分离鉴定
2.1 材料
2.1.1 病料来源、细胞和实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要器材
2.2 方法
2.2.1 病毒分离
2.2.2 分离株的鉴定
2.2.2.1 电镜观察
2.2.2.2 间接免疫荧光检测（IFA）
2.2.2.3 PCR 鉴定
2.2.2.4 TCID50 测定
2.2.2.5 家兔小鼠的攻毒实验
2.2.2.6 动物回归试验
2.3 结果
2.3.1 病原体电镜观察结果
2.3.2 间接免疫荧光检测（IFA）
2.3.3 TCID50 测定
2.3.4 家兔小鼠的攻毒实验
2.3.5 回归实验
2.3.6 B2L 和 F1L 基因鉴定及进化分析结果
第三章 单克隆抗体的制备
3.1 材料
3.1.1 细胞、细菌和实验动物
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器设备和耗材
3.2 方法
3.2.1 蛋白 B2L 的表达与纯化
3.2.2 免疫小鼠
3.2.3 间接 ELISA 方法检测抗体效价
3.2.4 杂交瘤细胞株的建立
3.2.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选
3.2.6 阳性杂交瘤细胞的克隆化
3.2.7 杂交瘤细胞的冻存和复苏
3.2.8 单克隆抗体的大量制备及初步纯化
3.2.9 杂交瘤细胞培养上清及初步纯化单抗 4E2 的效价测定
3.2.10 4E2 的纯化及浓度的测定
3.2.11 2E4 生物学活性鉴定
3.3 结果
3.3.1 蛋白 B2L 的诱导表达、纯化结果
3.3.2 抗原和血清最佳工作浓度的确立
3.3.3 小鼠免疫血清抗体效价检测
3.3.4 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选
3.3.5 单抗的大量制备及初步纯化
3.3.6 2E4 效价的测定
3.3.7 2E4 特异性鉴定
第四章 中和试验和免疫荧光实验
4.1 材料
4.1.1 毒株、细胞和动物
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 2E4 的中和试验
4.2.2 间接免疫荧光实验
4.3 结果
4.3.1 中和试验
4.3.2 免疫荧光检测 ORFV 在感染细胞内的分布情况
第五章 讨论
5.1 羊口疮病毒的分离鉴定
5.2 单克隆抗体的制备
5.3 中和试验和免疫荧光实验
第六章 结论
参考文献
致谢
附录
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]羊口疮病毒黑龙江省分离株的分离鉴定[J]. 于永忠,谭强,赵文博,包凯,崔玉东. 中国预防兽医学报. 2013(08)
[2]羊胚胎鼻甲细胞的原代培养及其在羊口疮病毒研究中的应用[J]. 汪园园,童双,李威,高丰,宁章勇,罗树红. 中国兽医科学. 2013(05)
[3]新疆羊口疮病毒分离鉴定及B2L基因分析与表达[J]. 李瑞芳,李国华,孟仁,乔军,张辉,陈创夫. 中国预防兽医学报. 2013(03)
[4]羊口疮病毒分子生物学的研究进展[J]. 闫丰超,邵佳,窦永喜. 中国兽医科学. 2013(01)
[5]羊口疮病毒农安分离株的分离鉴定及Orf059（F1L）基因的序列分析[J]. 苏高莉,赵魁,孙秀萍,何叶,周平,潘伟,包英夫,李吉达,宋德光,高丰. 中国兽医学报. 2013(01)
[6]湖北省羊口疮病毒的分离鉴定[J]. 王光祥,尚佑军,陈江涛,吕占禄,张克山,刘湘涛. 动物医学进展. 2012(11)
[7]羊口疮病毒B2L蛋白二级结构及其细胞表位的预测[J]. 王光祥,尚佑军,吕占禄,田宏,张克山,刘湘涛. 中国兽医科学. 2012(11)
[8]羊口疮病毒分子特征与免疫逃逸策略[J]. 于永忠,吴志军,朱战波,潘求真,崔玉东. 病毒学报. 2012(03)
[9]贵州地区羊口疮病毒B2L基因克隆及原核表达载体构建[J]. 向智龙,卓建华,程振涛,欧德渊,鲜思美,尹传宝,黄璐,禾彩红. 中国畜牧兽医. 2011(07)
[10]抗原表位研究方法进展[J]. 宋帅,李春玲,贾爱卿,杨冬霞,李淼. 动物医学进展. 2010(12)
博士论文
[1]羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究[D]. 赵魁.吉林大学 2010
硕士论文
[1]抗S.aureus TRAP蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析[D]. 周雪.黑龙江八一农垦大学 2012
[2]羊传染性脓疱病毒感染羔羊细胞免疫应答变化规律的研究[D]. 张冰冰.吉林大学 2011
[3]蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备[D]. 李文超.华中农业大学 2007
[4]羊传染性脓疱病毒生物学特性及PCR检测方法的研究[D]. 罗云.内蒙古农业大学 2006
[5]抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及应用研究[D]. 曹亮.新疆农业大学 2005
本文编号：3447249
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