鸡白痢沙门菌IpaJ蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用
发布时间：2021-10-20 17:08
鸡白痢沙门菌是宿主特异性致病菌,多侵害21日龄以内的雏鸡,引起白色痢疾,发病率和致死率极高;成年鸡感染后一般无临床症状,但使其处于持续带菌状态,导致体重减轻,产蛋量下降。鸡白痢沙门菌含有很多致病基因,其中ipaJ基因是在鸡白痢沙门菌中新发现的与毒力相关的基因,其编码的IpaJ蛋白参与细菌对机体的早期感染过程。研究表明ipaJ基因广泛存在于鸡白痢沙门菌中,且为鸡白痢沙门菌血清型所特有的基因,与其亲缘关系较近的其他血清型沙门菌则不含有该基因,如鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌等。本研究克隆表达了鸡白痢沙门菌ipaJ基因,制备了 IpaJ蛋白的单克隆抗体并建立了相应的检测技术,为鸡白痢沙门菌致病机制的研究和疾病诊断提供了重要的生物学材料。1鸡白痢沙门菌ipaJ基因的克隆及表达以鸡白痢沙门菌C79-13和福氏志贺菌SNI基因组为模板分别PCR扩增ipaJ基因。将ipaJ基因分别与原核表达载体pColdI和pMAL-c5X相连接构建重组原核表达质粒,通过双酶切以及测序鉴定,结果表明ipaJ基因成功克隆至原核表达载体上,且没有任何碱基突变。将构建成功的重组质粒分别命名为pColdI-SP-ipaJ（Sal...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－３重组表达载体ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－＿Ｊ酶切鉴
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ＥＬＩＳＡ实验结果，确定检测原蛋白ｒＭＢＰ－ＳＰ－ＩｐａＪ的最佳包被浓度是２ｎｇ／ｍＬ；免疫小??鼠血清的最佳稀释度为１：３２００时ＯＤ４５〇吸光度值为０．９９８，经分析最后确定将小鼠血??清１：３２００稀释度作为检测的阳性对照，图２－１中小鼠血清稀释梯度：从１：１００开始倍??比稀释。??４－１??｜〇?｜．ｉｇ／ｍＬ??？?表?＊?Ｈｔｈ?８?ｕｇ／ｒｎＬ??３?Ｘ＼?６?Ｍｇ／ｍＬ??！?＼??ｊ２＊?？？祉??°?＋?１?邮ｍＬ??１－?－ａ－?０．５Ｍｇ／ｎｉＬ??Ａ?０．２５?ｐ．ｇ，／ｍＬ??０?????１００?２００?４００?８００?１６００?３２００?６４００??图２－１方阵实验确定抗原最佳包被浓度??Ｆｉｇ．?２－１?Ｄｅｔｅｍｉｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒＭＢＰ－ＳＰ－ＩｐａＪ?ｏｐｔｉｍａｌ?ｗｏｒｋｉｎｇ?ｃｏｎｃｅｒｎｔｒａｔｉｏｎ??３．２阳性杂交瘤细胞株的建立??细胞融合成功后，利用３．１建立的间接ＥＬＩＳＡ检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，??并对杂交瘤细胞连续进行２次亚克隆，最终获得８株稳定分泌鸡白痢沙门菌ＩｐａＪ特??异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡白痢沙门氏菌胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用[J]. 刘志科,杨宁宁,徐明国,荆明龙,曹旭东,陈创夫. 河南科技学院学报(自然科学版). 2018(01)
[2]鸡白痢沙门菌研究进展[J]. 殷俊磊,李求春,耿士忠,潘志明,焦新安. 中国兽医学报. 2016(09)
[3]肉鸡产业链中沙门菌流行情况及其耐药性[J]. 谢懋英,赖婧,马立才,吴聪明,左之才. 中国兽医学报. 2014(11)
[4]鸡白痢的诊断与防治[J]. 范志炎. 畜牧与饲料科学. 2013(Z1)
[5]鸡白痢沙门氏菌的分离与鉴定[J]. 安辉,张大华,陈小玲,徐福洲,贺云霞,黄秀芬,李桂萍,孙惠玲. 安徽农业科学. 2011(32)
[6]免疫磁珠技术研究进展[J]. 于露,孙秀兰. 粮食与油脂. 2011(10)
[7]鸡白痢沙门菌ipaJ基因的克隆与鉴定[J]. 李求春,徐耀辉,黄金林,焦新安. 微生物学报. 2010(11)
[8]胶体金免疫层析法检测猪PRVgE抗体方法的建立及应用[J]. 白静,于新和,边传周. 河南科技学院学报. 2009(01)
[9]鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析[J]. 徐耀辉,焦新安,李求春,潘志明,黄金林. 中国兽医科学. 2007(07)
[10]鸡白痢和肠炎沙门氏菌抑制差减文库的构建与分析[J]. 李求春,焦新安,徐耀辉,潘志明,黄金林. 扬州大学学报(农业与生命科学版). 2007(01)
硕士论文
[1]我国部分地区鸡白痢沙门菌耐药性与耐药基因分析[D]. 李秀.扬州大学 2016
本文编号：3447284
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－３重组表达载体ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－＿Ｊ酶切鉴
３．１．３?重组质粒?ｐＣｏｌｄｌ－ＳＰ－中〇？／和?ｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＰ－＿／?的鉴定??将重组质粒ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－ｚ＞ａ／和ｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＰ－中〇／进行双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶??电泳，在预期位置均出现中基因特异性条带（如图１－３，?１－４所示），将ＧｅｎＢａｎｋ中??矽〇７基因序列与测序结果进行基因序列的Ｂｌａｓｔｎ比对，比对结果完全一致，表明??基因成功克隆至表达载体上。??Ｍ?１２?Ｍ?１?２?３??ｌ：ｌ：??图１－３重组表达载体ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－＿Ｊ酶切鉴图１－４重组表达载体ＰＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＰ－＿Ｊ??定图谱?酶切鉴定图谱??Ｆｉｇ．?１－３?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ?Ｆｉｇ．?１－４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ??ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＣｏｉｄＩ－ＳＰ－；＞ｃ／Ｊ?ｂｙ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＣｏｌｄｌ－ＳＰ－Ｚ／＾Ｊ?ｂｙ??ｗｉｔｈ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｗｉｔｈ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ??Ｍ：?ＤＬ５０００?Ｍａｒｋｅｒ?Ｍ：?ＤＬ５０００?Ｍａｒｋｅｒ??１－２：?ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－／＞ａｙ?１?－３：?ｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＰ－咖Ｊ??３．１．４重组质粒卩＼１八１＾５乂－８？－中〇／的鉴定??将重组质粒ｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＦ－＿Ｊ进行双酶切鉴定，经１％琼脂糖凝胶电泳，在预期??位置均出现中〇７基因特异性条带（如图１－５）
ＥＬＩＳＡ实验结果，确定检测原蛋白ｒＭＢＰ－ＳＰ－ＩｐａＪ的最佳包被浓度是２ｎｇ／ｍＬ；免疫小??鼠血清的最佳稀释度为１：３２００时ＯＤ４５〇吸光度值为０．９９８，经分析最后确定将小鼠血??清１：３２００稀释度作为检测的阳性对照，图２－１中小鼠血清稀释梯度：从１：１００开始倍??比稀释。??４－１??｜〇?｜．ｉｇ／ｍＬ??？?表?＊?Ｈｔｈ?８?ｕｇ／ｒｎＬ??３?Ｘ＼?６?Ｍｇ／ｍＬ??！?＼??ｊ２＊?？？祉??°?＋?１?邮ｍＬ??１－?－ａ－?０．５Ｍｇ／ｎｉＬ??Ａ?０．２５?ｐ．ｇ，／ｍＬ??０?????１００?２００?４００?８００?１６００?３２００?６４００??图２－１方阵实验确定抗原最佳包被浓度??Ｆｉｇ．?２－１?Ｄｅｔｅｍｉｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒＭＢＰ－ＳＰ－ＩｐａＪ?ｏｐｔｉｍａｌ?ｗｏｒｋｉｎｇ?ｃｏｎｃｅｒｎｔｒａｔｉｏｎ??３．２阳性杂交瘤细胞株的建立??细胞融合成功后，利用３．１建立的间接ＥＬＩＳＡ检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，??并对杂交瘤细胞连续进行２次亚克隆，最终获得８株稳定分泌鸡白痢沙门菌ＩｐａＪ特??异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡白痢沙门氏菌胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用[J]. 刘志科,杨宁宁,徐明国,荆明龙,曹旭东,陈创夫. 河南科技学院学报(自然科学版). 2018(01)
[2]鸡白痢沙门菌研究进展[J]. 殷俊磊,李求春,耿士忠,潘志明,焦新安. 中国兽医学报. 2016(09)
[3]肉鸡产业链中沙门菌流行情况及其耐药性[J]. 谢懋英,赖婧,马立才,吴聪明,左之才. 中国兽医学报. 2014(11)
[4]鸡白痢的诊断与防治[J]. 范志炎. 畜牧与饲料科学. 2013(Z1)
[5]鸡白痢沙门氏菌的分离与鉴定[J]. 安辉,张大华,陈小玲,徐福洲,贺云霞,黄秀芬,李桂萍,孙惠玲. 安徽农业科学. 2011(32)
[6]免疫磁珠技术研究进展[J]. 于露,孙秀兰. 粮食与油脂. 2011(10)
[7]鸡白痢沙门菌ipaJ基因的克隆与鉴定[J]. 李求春,徐耀辉,黄金林,焦新安. 微生物学报. 2010(11)
[8]胶体金免疫层析法检测猪PRVgE抗体方法的建立及应用[J]. 白静,于新和,边传周. 河南科技学院学报. 2009(01)
[9]鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析[J]. 徐耀辉,焦新安,李求春,潘志明,黄金林. 中国兽医科学. 2007(07)
[10]鸡白痢和肠炎沙门氏菌抑制差减文库的构建与分析[J]. 李求春,焦新安,徐耀辉,潘志明,黄金林. 扬州大学学报(农业与生命科学版). 2007(01)
硕士论文
[1]我国部分地区鸡白痢沙门菌耐药性与耐药基因分析[D]. 李秀.扬州大学 2016
本文编号：3447284
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