鸭瘟病毒UL1与gH蛋白相互作用的初探

发布时间：2021-10-21 02:14

　　1、鸭瘟病毒UL1基因的生物信息学分析对DPV UL1基因的核酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息、学分析。结果表明：DPV UL1基因编码的蛋白由236aa组成,分子量约为26221.08Da,等电点为8.480,其中Val、Gly、Arg的含量最高,分别为9.8%、8.5%、8.1%。对其编码蛋白的氨基酸序列进行进化树分析,表明DPV更接近α疱疹病毒亚科的Simplexvirus属。DPV UL1基因编码蛋白有信号肽、无跨膜区,其抗原表位主要集中在27-33、63-64、87-106、151-153、155-157、167-196、204-210、214-236aa。预测DPV UL1编码蛋白可能含有5个O-糖基化位点、7个丝氨酸位点、2个苏氨酸位点、1个酪氨酸位点。亚细胞定位分析表明,DPV UL1基因编码蛋白存在于细胞核、细胞浆及线粒体中的可能性分别为4.3%、17.4%和47.8%。2、鸭瘟病毒UL1基因的原核表达、蛋白纯化及多抗制备由于DPV UL1的全基因在原核表达系统中无法表达,所以根据生物信息学分析,设计了一对特异性引物,扩增UL1基因上除去信号肽部分但包含了主... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
第一部分 引言
    1 疱疹病毒膜融合的机理
    2 疱疹病毒的gH/gL复合物
    3 疱疹病毒gL蛋白的特点
    4 疱疹病毒gL蛋白的功能
    5 展望
    6 本研究目的和意义
第二部分 试验研究
    1 试验材料
        1.1 DPV UL1基因序列与偏爱性数据
        1.2 毒株、菌株、抗体、质粒、引物、细胞
        1.3 试验动物
        1.4 主要仪器设备
        1.5 主要试剂及配制
            1.5.1 主要试剂
            1.5.2 试剂配制
    2 试验方法
        2.1 生物信息学分析
        2.2 鸭瘟病毒UL1基因克隆、原核表达、蛋白纯化及多抗制备
            2.2.1 DPV基因组DNA的提取
            2.2.2 DPV UL1基因的PCR扩增与T克隆
            2.2.3 感受态细胞制备
            2.2.4 感受态细胞的转化
            2.2.5 T克隆的鉴定
            2.2.6 重组原核表达质粒pET32a(+)-gLt的构建
            2.2.7 重组原核表达质粒pET32a(+)-gLt的表达
            2.2.8 重组gLt蛋白的制备与纯化
            2.2.9 重组gLt蛋白的透析与冻干
            2.2.10 Western Blot法检测重组gLt蛋白的反应原性
            2.2.11 制备兔抗重组gLt蛋白多克隆抗体
            2.2.12 琼脂双向扩散法检测抗体效价
            2.2.13 饱和硫酸铵盐析沉淀法粗提IgG
            2.2.14 High Q阴离子交换层析法纯化IgG
            2.2.15 兔抗gLt蛋白IgG的纯度鉴定
        2.3 鸭瘟病毒UL1蛋白在感染DEF内的定位分析
            2.3.1 间接免疫荧光法检测方法的建立
            2.3.2 间接免疫荧光法检测方法的优化
            2.3.3 特异性检测
            2.3.4 结果判定
            2.3.5 UL1蛋白在DEF内定位的动态分析
        2.4 鸭瘟病毒UL1基因类型的分析与表达时相分析
            2.4.1 DPV UL1基因在病毒感染DEF细胞中的表达时相分析
            2.4.2 药物抑制试验鉴定DPV UL1基因类型
        2.5 免疫荧光双标研究DPV UL1蛋白与gH蛋白的相互作用
            2.5.1 DPV UL1基因真核表达载体的构建
            2.5.2 重组质粒pCMV-HA-gH和pCMV-Myc-gL共转染HEK293细胞
            2.5.3 免疫荧光双标
    3 试验结果
        3.1 生物信息学分析
            3.1.1 DPV UL1基因核酸序列分析
            3.1.2 DPV UL1蛋白氨基酸组分分析
            3.1.3 DPV UL1蛋白质的保守结构域
            3.1.4 DPV UL1蛋白氨基酸序列的多序列比对与进化树分析
            3.1.5 DPV UL1蛋白的信号肽预测
            3.1.6 DPV UL1蛋白的跨膜区预测
            3.1.7 DPV UL1蛋白功能位点预测
            3.1.8 DPV UL1蛋白疏水性分析
            3.1.9 DPV UL1蛋白磷酸化位点预测
            3.1.10 DPV UL1蛋白糖基化位点预测
            3.1.11 DPV UL1蛋白的B抗原表位分析
            3.1.12 DPV UL1蛋白的二级结构预测
            3.1.13 DPV UL1蛋白的亚细胞定位
            3.1.14 DPV UL1蛋白的密码子偏嗜性分析
        3.2 鸭瘟病毒UL1基因克隆、原核表达、蛋白纯化及多抗制备
            3.2.1 DPV UL1截段基因gLt的扩增、T克隆及亚克隆的构建
            3.2.2 重组原核质粒pET32a(+)-gLt的表达条件优化
            3.2.3 重组gLt蛋白的纯化
            3.2.4 Western blot检测gLt重组蛋白的反应原性
            3.2.5 兔抗重组蛋白gLt血清的效价检测以及纯化
        3.3 鸭瘟病毒UL1蛋白在感染DEF内的定位分析
            3.3.1 间接免疫荧光法检测方法的条件优化
            3.3.2 特异性检测
            3.3.3 DPV UL1蛋白在病毒感染细胞中的动态分布
        3.4 鸭瘟病毒UL1基因类型的分析与表达时相分析
            3.4.1 DPV UL1基因在病毒感染细胞中的表达时相分析
            3.4.2 琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整
            3.4.3 药物抑制试验确定UL1基因类型
        3.5 免疫荧光双标研究DPV UL1蛋白与gH蛋白的相互作用
            3.5.1 真核表达载体pCMV-Myc-gL的鉴定
            3.5.2 DPV UL1蛋白与gH蛋白在HEK293细胞内的共定位
    4 讨论
        4.1 生物信息学分析
            4.1.1 DPV UL1基因及其编码蛋白的分子特性
            4.1.2 DPV UL1基因编码蛋白的遗传特性和同源性
            4.1.3 DPV UL1基因密码子偏嗜性研究
        4.2 鸭瘟病毒UL1基因克隆、原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备
        4.3 鸭瘟病毒UL1基因编码蛋白在感染DEF内的定位分析
        4.4 鸭瘟病毒UL1基因类型的分析与表达时相分析
        4.5 鸭瘟病毒UL1蛋白与gH蛋白在HEK293细胞内的共定位
第三部分 结论
参考文献
致谢
作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
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[3]密码子偏性的分析方法及相关研究进展[J]. 吴宪明,吴松锋,任大明,朱云平,贺福初.  遗传. 2007(04)
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[6]影响多重PCR扩增效果的因素[J]. 黄银花,胡晓湘,徐慰倬,高宇,冯继东,孙汉,李宁.  遗传. 2003(01)
[7]鸭病毒性肠炎病毒基因文库的构建及其核衣壳蛋白基因的发现、克隆与鉴定[J]. 程安春,汪铭书,文明,周伟光,郭宇飞,贾仁勇,徐超,袁桂萍,刘一尘.  高技术通讯. 2006 (09)

硕士论文
[1]鸭瘟病毒UL35基因的原核表达、蛋白纯化、转录时相、表达时相及亚细胞定位[D]. 蔡铭升.四川农业大学 2009



本文编号：3448043