新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建及IL-8相关基因的筛选

发布时间：2021-10-22 03:49

　　本文以多浪羊外周血淋巴细胞为实验材料,采用SMART技术,构建了多浪羊外周血淋巴细胞的cDNA文库,用地高辛标记的IL-8探针与构建的文库进行核酸杂交筛选,并对筛选结果进行了初步分析。首先,从多浪羊外周血中分离淋巴细胞,用Trizol提取多浪羊外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录合成了第一链cDNA,LDPCR扩增后获得双链DNA,采用蛋白酶K和Sfi I消化,产生的接头和cDNA片段经CHROMA SPIN-400柱离心分离,收集400bp以上的cDNA片段,然后将这些外源片段与λTriplEx2 Vector载体连接后转染噬菌体,测定初始文库滴度,之后进行文库扩增。结果表明,构建的cDNA文库初始滴度为5.6×107pfu/mL,克隆文库滴度为1.5×10pfu/mL。由此结论说明所构建的多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库容量符合文库构建的标准,该cDNA文库可以方便地从中筛选所需的目的基因,更为重要的是可以用于分离全长基因,为更进一步开展基因功能研究奠定基础。以地高辛标记的IL-8基因为探针,在多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库中进行非特异性筛选免疫应答相关基因,经2轮筛选挑取阳性克隆菌... 

【文章来源】：塔里木大学新疆维吾尔自治区

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

一多浪羊淋巴细胞总RNA电泳图谱

１．２．４?ｃＤＮＡ第二链合成ＰＣＲ结果鉴定??ｍＲＮＡ经第一链合成后再经ＰＣＲ合成第二链，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可??见ｄｓＤＮＡ形成弥散条带在０．１￣４ｋｂ之间，如图１－３所示。??５０００ｂ＾??４ｎｎｎｖ．＾．＇?■??３０００ｂｐ／??２０００ｂｐ??２００?Ｏｂｐ＾??■ＥｆｌＦ＾Ｗ＝＝ｌ〇〇〇ｂｐ??謂叫??图１－３多浪羊淋巴细胞ｄｓＤＮＡ电泳图谱??Ｍｌ：?ＤＮＡ分子量标准（１Ｋｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量标准（ＤＬ２０００）；泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇｌ－３?Ｄｕｏｌａｎｇ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａＪ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒ＞ｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌ?Ｋｂ）？?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）？??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??１．２．５?ｃＤＮＡ初始文库的滴度的检测??取初始文库（３叫ｃＤＮＡ，２５ｎＬ包装蛋白，５００ｐＬＳＭ?ｂｕｆｆｅｒ，?２〇ｎＬ氯仿）ｌ＾Ｌ稀释为??１０－１、１０＿２、１０－３和１０＂４涂板，３７°Ｃ过夜培养后取出平皿，计数噬菌斑的数量，１０－２为５６２个，??１０－３为６７个

１．２．４?ｃＤＮＡ第二链合成ＰＣＲ结果鉴定??ｍＲＮＡ经第一链合成后再经ＰＣＲ合成第二链，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可??见ｄｓＤＮＡ形成弥散条带在０．１￣４ｋｂ之间，如图１－３所示。??５０００ｂ＾??４ｎｎｎｖ．＾．＇?■??３０００ｂｐ／??２０００ｂｐ??２００?Ｏｂｐ＾??■ＥｆｌＦ＾Ｗ＝＝ｌ〇〇〇ｂｐ??謂叫??图１－３多浪羊淋巴细胞ｄｓＤＮＡ电泳图谱??Ｍｌ：?ＤＮＡ分子量标准（１Ｋｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量标准（ＤＬ２０００）；泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇｌ－３?Ｄｕｏｌａｎｇ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａＪ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒ＞ｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌ?Ｋｂ）？?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）？??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??１．２．５?ｃＤＮＡ初始文库的滴度的检测??取初始文库（３叫ｃＤＮＡ，２５ｎＬ包装蛋白，５００ｐＬＳＭ?ｂｕｆｆｅｒ，?２〇ｎＬ氯仿）ｌ＾Ｌ稀释为??１０－１、１０＿２、１０－３和１０＂４涂板，３７°Ｃ过夜培养后取出平皿，计数噬菌斑的数量，１０－２为５６２个，??１０－３为６７个


本文编号：3450323